外泌體miRNA-124在顱腦創傷過程中表達及意義的研究進展

王 策 ，黃忻濤，閆青云，徐新娟，汪 易，楊亞軍

顱腦創傷是指由突發機械力作用于頭部而造成不同程度的急性腦損傷，目前仍是成年人死亡和殘疾的主要原因，很多幸存者也因其殘留著各種后遺癥而影響其認知、感覺、運動和情緒等，生活質量大大降低[1-2]。臨床上評估顱腦創傷病人病情嚴重程度及預后常采用格拉斯哥昏迷評分(Glasgow Coma Scale，GCS)、臨床癥狀及影像學表現等，但在實踐過程中，病人的意識水平可能被鎮靜藥物、中毒等影響所掩蓋，從而影響臨床醫生對病人做出準確的判斷。盡管隨著社會及技術的發展，顱腦創傷病人在支持治療和康復護理等方面得到了改善，但目前仍無有效的方法對其進行診斷、評估病情及預測預后等，以降低顱腦創傷的死亡率并改善功能恢復[3]。有研究表明，顱腦創傷會引起血清外泌體miRNA的變化，這可能會對細胞間信號傳導和顱腦創傷后的疾病進展產生重要影響[4]。血清或血漿miRNA已被報道為許多中樞神經系統疾病特異和敏感的生物標志物，包括顱腦創傷[5]。miRNA-124(miR-124)作為中樞神經系統內含量最豐富的特異性miRNA，有望成為一種新的血清生物標志物，來評估顱腦創傷的嚴重程度、改善預后及預測疾病進展。

1 顱腦創傷的特點及病理生理

在公共衛生領域中，顱腦創傷一直是全世界導致人類損傷性死亡和致殘的主要原因。常見的顱腦創傷有腦震蕩、腦挫裂傷、顱內血腫等，從而引發不同程度的意識、運動及感覺障礙。顱腦創傷已經成為全球疾病負擔的第三大常見原因。據估計，全球每年約有1 000萬人受到顱腦創傷的影響，尤其是兒童和青年人。有統計資料顯示，我國的顱腦創傷病人數量遠超世界各國，交通事故、跌倒、暴力因素等均是導致顱腦創傷的常見原因[6]。顱腦創傷的損傷一般可分為原發性損傷和繼發性損傷兩個階段。原發性損傷是指機械外力對腦組織的直接沖擊，包括腦挫裂傷、顱內出血、彌漫性軸索損傷等，這些損傷可導致細胞瞬間死亡，也正因此，顱腦創傷最初被定義為急性損傷綜合征[7]。繼發性損傷涉及一系列生物過程，即原發性損傷后的神經炎癥反應、氧化應激、神經細胞的損傷、免疫反應、細胞凋亡、血腦屏障破壞等這些過程及其潛在的分子機制形成了一個復雜而有序的網絡，貫穿于顱腦創傷的整個過程，且繼發性損傷是導致腦水腫、顱內高壓及隨后神經功能障礙的主要原因[8]。由于原發性損傷被認為無法在治療上得到控制，因此，繼發性損傷的治療受到了更多的關注，控制和調節繼發性腦損傷的發展可能有利于顱腦創傷的預后[9]。然而目前對于顱腦創傷的準確診斷、預測預后和臨床治療依舊受到較大的限制，許多研究人員為此進行了大量深入的研究，尤其是分子機制方面，以期獲得分子生物標志物來反映其病理生理學特征，并對其進行干預治療。

2 外泌體miRNA的特點及與顱腦創傷的關系

外泌體是一種可由多種細胞釋放到細胞外的直徑為30～150 nm的微小囊泡，幾乎存在于所有的體液中(羊水、血液、尿液、腦脊液等)，具有高度的可調節性，并且可以參與細胞間的信號傳遞及信息交流等，包含多種蛋白質和脂質[10]。外泌體因其具有的脂質雙分子層結構，表明了它不僅便于長期儲存，而且可以很輕松地通過血腦屏障。因此，近年來對于外泌體的形成、轉運、功能和臨床應用等方面的研究明顯增加，逐漸表明了外泌體在診斷和治療中的應用，尤其是神經系統疾病中，具有廣泛的可能性[11]。外泌體內包含有多種RNA，其中miRNA是最豐富的物種，穩定存在于許多哺乳動物細胞中。miRNA是一類長度17～25個核苷酸的功能性單鏈小RNA，通常位于內含子內，通過與靶基因的3′-UTR相結合，在調節基因或蛋白質表達過程中發揮關鍵作用[12-13]，參與細胞增殖、分化、凋亡等生命活動。miRNA可調節超過1/3人類基因的表達，其中單個miRNA可以靶向多個基因，一個基因也可以被一組miRNA所靶向[14]。越來越多的研究報道表明，miRNA不僅參與細胞周期正常的生物學過程如細胞分化凋亡、血管生成代謝等，還參與氧化應激、炎癥反應、細胞增殖等基因的表達和調控等相關機制[15]，同時在突觸形成、神經發生、分化和成熟等過程中也發揮著重要作用。2010年，Redell等[16]在顱腦創傷后檢測到腦脊液和血液中miRNA表達水平的改變，并且檢測到輕度和重度顱腦創傷(TBI)之間不同的miRNA表達譜，提示其作為損傷生物標志物的潛在用途。有人在顱腦損傷鼠模型的海馬中檢測到有31～50種miRNA表達的下調以及16～35種miRNA表達的上調，這些miRNA參與細胞分化、增殖等功能。有研究表明miR-21可以通過靶向調節抑癌基因(PTEN)、血管內皮生長因子(VEGF)基因等，激活血管生成素-1(Ang-1)/酪氨酸蛋白激酶受體2(Tie-2)和蛋白激酶B(Akt)信號傳導，從而促進顱腦損傷和腦卒中后神經元軸突的生長[17]；另外，也有研究指出，miR-146a被認為是炎癥的負性調節因子，可以由核轉錄因子-κB(NF-κB)激活誘導，而后通過抑制白細胞介素-1受體相關激酶-1(IRAK1)和腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)的表達來反饋該途徑，從而降低了NF-κB的活化及T細胞的黏附，進一步抑制炎癥反應。因此，miR-146a在各種神經系統疾病中的上調提示著機體正處于抑制炎癥并恢復穩態的狀態下[18]。

miRNA在癌癥研究方面已經取得了長足的進步，在臨床試驗中miRNA已經被用作診斷、治療和預測預后的癌癥生物標志物。顱腦創傷是一種復雜的生理過程，涉及多種病理生理機制，損傷后的腦組織會發生一系列的病理生理變化(包括缺血缺氧、炎癥、應激反應、血管生成、神經發生等)，而在這一系列過程中，miRNA已被指出具有特征性的改變，并參與繼發性腦損傷過程，如促進神經元再生和凋亡，減輕血腦屏障(BBB)的滲漏，減少炎癥反應等方面。基于此，miRNA作為中樞神經系統內最具特異性和敏感性的生物標志物之一，極有可能成為一個潛在靶點，在顱腦損傷后的診斷、評估病情及干預治療等方面發揮重要作用。

3 外泌體miR-124在神經系統組織中的表達

Lagos-Quintana等[19]在2002年的研究中首次發現miR-124在小鼠的腦組織中高表達，并且認為其在小鼠、大鼠和人類之間具有同源性。近10余年來，人們對于miR-124的認識也在不斷加深。在哺乳動物的神經系統內，miR-124是含量最豐富的miRNA，約占成年人大腦miRNA總量的25%～48%，且在除了腦垂體以外的腦組織中特異性高表達，尤以大腦皮層為著[20]。miR-124的高表達提示其在中樞神經系統中有著舉足輕重的作用，也因此成為神經生物學最受關注的miRNA之一。miR-124有miR-124-1、miR-124-2、miR-124-3三條未成熟的前體序列，分別位于染色體的8p23.1、8q12.3和20q13.33上[20]，他們被雙鏈專一性RNA內切酶Dicer酶剪切后成為成熟的miR-124序列，然后與下游靶基因序列結合，從而發揮生物學效用[21]。miR-124的配對方式使其能夠識別并作用于數百種miRNA，通過實用miRNA分子靶基因預測數據庫對人類miR-124靶基因進行預測并結合韋恩分析，預測不同數據庫中的256個靶分子，其中孤兒核受體4A1(NR4A1)、內質網應激相關蛋白1(SERP1)、Rho相關激酶(ROCK1)等在腦發育及神經損傷修復過程中起著非常重要的作用[22]。近年來，隨著研究的進展，miR-124與中樞神經系統疾病之間的關系變得越來越明確，miR-124逐漸被探索到在氧化應激、炎癥調節、血管再生、神經發育、免疫反應、軸突再生與修復等一系列過程中發揮重要作用[23]。

4 外泌體miR-124參與顱腦損傷可能的機制

4.1 miR-124促進中樞神經系統發育，并參與調控顱腦損傷后神經發生與損傷修復

4.1.1 促進神經元的分化與成熟 早在2005年多項研究就已報道，miR-124作為中樞神經系統含量豐富的miRNA，優先在神經元中表達，并且發現其表達在中樞神經系統發育過程中逐漸增加并與神經元的成熟相平行[24]。與啟動子結合的RE-1沉默轉錄抑制物(REST)可以降解非神經性轉錄產物，而miR-124則可以拮抗REST的作用。在神經元誘導的過程中，miR-124的表達與REST形成負反饋調控網絡，REST因受到調控呈低表達，相反miR-124卻得以釋放出來得到表達，進一步參與神經祖細胞抑或是非神經樣細胞向神經元的轉化[25]。多聚嘧啶核苷酸序列結合蛋白(PTBP)是一種選擇性剪切調控蛋白，具有多種亞型，有研究顯示，PTBP1可以抑制PTBP2，而miR-124卻又能夠抑制PTBP1，使得PTBP2的表達升高，進而使蛋白的表達朝著神經元方向進行，并使神經干細胞向著神經元方向分化[26]。顱腦損傷后的組織損傷過程在神經保護及修復機制中演變，引發對損傷一系列的生化反應，導致神經元修復或凋亡細胞凋亡等，miR-124可以促進神經元的分化與成熟，有望成為神經損傷后修復的作用靶點。Yang等[27]的研究利用修飾的外泌體將miR-124靶向性地傳遞到缺血皮質，發現miR-124促進了缺血后大腦皮層的神經發生。

4.1.2 促進神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的增殖與分化 神經干細胞是一種多能、未分化的細胞，具有向神經細胞和膠質細胞分化的潛能。在哺乳動物中樞神經系統中，神經干細胞主要存在于海馬區及室管膜下區，不僅具有神經元及神經細胞再生的能力，還可以遷移并整合入受損傷的腦組織，對顱腦損傷造成的神經結構、組織損傷等進行修復[28]。Notch信號通路通過調控靶基因的表達來影響細胞的增殖、存活和凋亡，在神經干細胞的維持與神經再生中起關鍵作用。有報道稱，在體外環境下，miR-124以DLL4為作用靶點，抑制Notch信號通路活化從而促進神經干細胞的增殖與向神經性分化[29]，提示miR-124能夠參與Notch信號通路來發揮對神經干細胞的調控作用。在Wnt/β-catenin信號通路中，腫瘤抑制因子β1連環蛋白抑制基因1(DACT1)已被闡明可以通過降解B-連環蛋白來阻斷下游基因的轉錄，并且該通路已被證明與基質細胞(ESCs)的自我更新和神經元分化有關[30]。miR-124可以通過與DACT1的3′UTR片段結合負調控DACT1的表達和激活Wnt/β-catenin信號通路來促進神經干細胞的增殖和向神經元分化。Yang等[31]通過對顱腦損傷后大鼠海馬神經發生的研究表明，miR-124可以通過促進顱腦損傷后小膠質細胞M2極化，進而促進海馬神經干細胞的增殖和神經元分化，改善及恢復腦損傷后的神經功能。神經干細胞具有生成和再生大腦的能力，miR-124可以作用于其相應的靶點，在NSCs的存活、擴增和分化中起調節作用，并促進多種神經干細胞或祖細胞向神經元方向分化，表明顱腦損傷后通過神經損傷修復細胞來干預治療這一方式的可能性，為促進顱腦損傷后的神經元再生和神經功能恢復提供了有效的靶向生物治療思路。

4.1.3 促進顱腦損傷后神經元突起的再生與修復 神經元的突起不僅可以將胞體發出的沖動傳遞給另外一個神經元，同時也是神經元接收信號的重要門戶。有研究表明，在神經發育過程中，miR-124基因的缺失使得小鼠出現軸突生長缺陷、腦體積減小甚至神經細胞死亡[32]，適度的miR-124表達有利于損傷后的軸突修復。顱腦損傷后發生的一系列病理生理過程導致神經元大量損傷及神經功能嚴重缺失，軸突再生困難，因此，促進受損的神經元恢復及軸突的正確生長連接，已成為治療顱腦損傷并改善預后的一個研究熱點。蘇鑫洪等[33]在小鼠皮層神經元機械損傷模型初步研究中表明了在顱腦損傷后的病理狀態下，適量的miR-124高表達，更有利于損傷后軸突的修復。Wang等[34]證明了miR-124可以促進受損神經元突起的生長，包括神經突起的分支數目和總長度增加。組蛋白去乙酰化酶5(HDAC5)和 Ras家族同源性生長相關基因(RhoG)可能是miR-124促進神經元突觸延伸的一個靶點：HDAC5可抑制C57/BL小鼠皮層神經元突觸的生長和延伸，而miR-124能夠抑制HDAC5的表達，因此，當miR-124高表達時可以促進神經元突觸和軸突的生長[35]；在吞噬和細胞運動蛋白(ELMO)/Dock180/Ras相關的C3肉毒桿菌毒素底物1(Rac1)的通路中，大鼠海馬神經元內RhoG的活性增強可以抑制突觸形成與突起延伸，而miR-124則可與RhoG的3′UTR結合，抑制RhoG的表達，從而促進突觸形成與突起延伸的發生[36]。這些都為進一步研究顱腦損傷后的神經干預治療提供了基礎。

4.2 miR-124參與顱腦損傷后缺血缺氧調節 大腦消耗了全身20%的氧氣攝入量，因此，腦血供的喪失(血管斷裂或低灌注等)會導致嚴重的神經病理學影響。顱腦損傷后因腦血管受到擠壓或牽拉所引起的痙攣、管腔狹窄等會導致其供血區域缺血缺氧的狀態，這種改變如不能及時緩解，則將進一步導致創傷性腦梗死的發生。近年來，研究者已經確認缺血區的新生血管形成是顱腦損傷后神經修復與再生的關鍵因素，且外泌體miR-124水平與腦梗死體積、血清白細胞介素-6水平及美國國立衛生院卒中量表(NIHSS)評分呈正相關[37]，隨著研究的不斷深入，有研究表明外泌體介導的miRNA轉運可有效地將miR-124轉運至缺血區，并通過促進神經祖細胞在缺血部位獲得神經元表型，從而改善顱腦損傷[38]；隨后Sun等[39]在研究miR-124對剝奪了氧氣和葡萄糖后誘導細胞凋亡相關蛋白的影響中發現，缺血區域的miR-124表達水平較未缺血區域顯著升高。顱腦損傷后的腦組織缺血缺氧是導致繼發性損傷的一個關鍵點，各項研究均顯示miR-124在缺血性腦損傷的發病機制和病理過程中起著重要作用，低灌注缺氧會引起miR-124表達的改變，繼而作用于其相應靶點來改善腦損傷的恢復。

4.3 miR-124參與調控顱腦損傷后的炎癥反應 顱腦損傷后的病人明顯存在著氧化應激和炎癥反應，神經炎癥反應在中樞神經系統抵御病原體侵襲和修復組織損傷過程中起著重要作用，也提示著顱腦損傷病人的預后。雖然炎癥本身導致了繼發性顱腦損傷的擴大及不良反應，但其也介導了顱腦損傷后的神經保護與修復機制。因此，適度的炎癥反應對于機體而言是有益處的，在一定程度上對損傷的腦組織有保護作用[40]。①哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在顱腦損傷后免疫炎癥反應的調節中起著重要作用，而磷酸二酯酶4B(PDE4B)是唯一與mTOR信號相關的合格基因，并且可以被miR-124所靶向。miR-124可以通過直接靶向PDE4B來抑制mTOR信號的活性，從而抑制下游靶點p-4E-BP1和p-P70S6K的磷酸化水平，減少促炎細胞因子的釋放以及促進抗炎細胞因子的表達來抑制神經元炎癥[41]。②在顱腦損傷發生后，損傷細胞所釋放的損傷相關分子模式(DAMP)短時間內即可與小膠質細胞表面的Toll樣受體和Nod樣受體結合，損傷處激活的小膠質細胞具有M1和M2樣混合表型[42]，分別被認為與神經系統促炎及抗炎過程相關。miR-124可以通過調控Toll樣受體通路，促進小膠質細胞從M1向M2表型分化，調控顱腦損傷后過度的炎癥反應，從而起到神經保護的作用[43]。此外，miR-124還可以通過轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBP-α)途徑促進小膠質細胞向抗炎M2表型分化[44]，以及通過有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(MEKK)/NF-κB信號通路介導小膠質細胞的炎癥反應[45]，從而發揮神經保護及調控炎癥過程的作用。③miR-124可通過膽堿能抗炎通路以及迷走神經在巨噬細胞中發揮抗炎作用。具體過程為迷走神經作用于脾T細胞，脾T細胞產生乙酰膽堿，乙酰膽堿與巨噬細胞上的α7-煙堿乙酰膽堿受體結合，以促進抗炎極化[46]。在這些巨噬細胞內，miR-124可以通過降低轉錄激活因子3(STAT3)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)轉化酶來驅動抗炎極化，繼而抑制炎性因子的釋放，發揮膽堿能抗炎作用來調節炎癥反應。由此可見，miR-124作為腦內含量最豐富的miRNA，在神經元和膠質細胞信號傳遞中發揮著重要作用，調控著炎癥反應[47-48]，并參與多個病理生理過程，提示其具有協助早期診斷、預測預后及成為治療靶點的潛力。

miR-124作為在中樞神經系統特異性高表達的miRNA，隨著研究的不斷深入，已逐漸展現出其廣泛的調節功能及對疾病發生發展的復雜效應，因而已成為最受關注的神經生物學研究熱點之一，為神經系統疾病的診斷和治療提供了新思路。顱腦損傷后miR-124的動態表達變化及相關作用機制已被初步闡明或證實，表明了其作為顱腦損傷特異性診斷標志物、干預治療或預測預后的巨大潛力。然而，對于miR-124在顱腦損傷的診療領域的研究才剛剛起步，可能還有許多潛在的機制未被發現，需要更多、更深入的研究來進一步明確。

5 小 結

顱腦損傷是一種廣泛存在的中樞神經系統疾病，其致死率及致殘率仍居全身創傷性損傷的首位。傳統的影像學檢查[CT或磁共振成像(MRI)等]及評分標準在臨床實踐中通常用于診斷和分類顱腦損傷，但其敏感程度和精度往往受限，因此，亟須一種普遍存在且易獲得的分子生物學標志物來反映疾病的病理生理學特征，這對于確定顱腦損傷病人的損傷程度及預測預后等非常重要。近年來，有關外泌體miR-124的研究越來越多，人們逐漸認識到其作為各種神經系統疾病細胞中相互交流和交換各種生物信息的主要載體，在顱腦損傷后的診斷、預測預后及進一步臨床治療中的相關分子機制也逐漸顯現出來，有望作為一種新型生物標志物發揮重要作用。

在顱腦損傷后的損傷修復機制中，大量的相關因子參與其中建立聯系并發揮作用，因此，不必僅局限于某單個miRNA，其可能與一組相關因子建立聯系，共同發揮作用。為了開發預防或改善顱腦損傷后的長期損傷和缺陷的治療靶點，需要進一步明確miR-124與顱腦損傷發病機制之間關系的確切分子機制，從而更準確地為其作為生物標志物和未來治療靶點、進一步理解顱腦損傷的發生、發展提供全新的視角。