白藜蘆醇在骨關節炎中的作用及機制研究進展

褚云峰 于紅燕 楊琪 彭艷斌 陳仲 劉明 于斐,3*

1. 北京大學深圳醫院，廣東 深圳 518036 2. 濱州市濱城區市立醫院，山東 濱州 256600 3. 骨科生物材料國家地方聯合工程研究中心，廣東 深圳 518036

骨關節炎(osteoarthritis,OA)又稱退行性關節炎，是一種以關節軟骨退變及骨質增生為特征的常見慢性關節疾病。原發性OA可能由于軟骨營養或代謝異常、應力不平衡、關節生化改變等因素造成，繼發性OA可能由于關節結構異常、關節不穩定、損傷或機械性因素等造成。隨著我國人口老齡化程度的不斷加劇，OA患者的基數也越來越多，嚴重者可以造成殘疾，給患者及衛生醫療帶來沉重負擔。近年研究顯示，中藥成分如白藜蘆醇[1]、淫羊藿[2]、小檗堿[3]等，基因如沉默信息調節因子1(SIRT1)[4]、無翅型MMTV整合位點家族成員5A(Wnt5a)[5]、固醇調節元件結合蛋白2(SREBP2)[6]等均可對OA的進程產生影響，也因此廣受關注。

白藜蘆醇屬天然抗氧化物質，在虎杖、花生、葡萄等植物中含量豐富。其存在順式和反式兩種同分異構體，自然界中主要以后者為主。國內外研究證實，白藜蘆醇在骨科[7]、心血管[8]、腫瘤[9]等疾病中起重要作用，廣泛應用于研究，并作為保健品被人群重視。此外，白藜蘆醇能夠通過核因子-κB(NF-κB)[10]、Toll樣受體4(TLR4)[11]、細胞外信號調節激酶(ERK)[12]等通路作用于關節軟骨并參與到OA的進展中。本文擬對白藜蘆醇通過影響軟骨衰老、軟骨基質代謝、軟骨損傷等作用參與OA的發生發展進程及NF-κB、TLR4、ERK等通路在其中的調控機制研究作一綜述，為相關研究者提供參考。

1 白藜蘆醇性質、發現及作用

白藜蘆醇的化學式為C14H12O3，其化學名稱為(E)-3,4’,5-三羥基二苯乙烯，相對分子量228.25。最初于1924年發現，并于1940年由日本科學家從毛葉藜蘆的根莖中獲得，在植物遇到不利影響時合成分泌增多，被稱為植物抗毒素。白藜蘆醇難溶于水，易溶于有機溶劑，熔點在253 ℃～ 255 ℃。365 nm紫外光照射可顯示熒光，與三氯化鐵-鐵氰化鉀及氨水等堿性溶液可起顯色反應，從而用于白藜蘆醇的鑒定。白藜蘆醇藥理作用多樣，能夠抗炎、抗氧化、抗菌及抗腫瘤等[13]。近年研究顯示，白藜蘆醇在骨科疾病如OA[14]、骨質疏松癥[15]、神經損傷修復[16]中起著重要作用。

2 白藜蘆醇在OA中對軟骨功能的影響

關節軟骨為透明軟骨或纖維軟骨，軟骨組織由外到內依次為表層、移行層、輻射層和鈣化層。關節軟骨由軟骨細胞和軟骨基質構成，軟骨細胞是其中唯一的細胞，基質主要為II型膠原和蛋白多糖。軟骨維持正常結構對機體非常重要，當關節軟骨出現退變，或者關節周圍出現骨贅，可導致OA。

2.1 白藜蘆醇對軟骨衰老的影響

白藜蘆醇是SIRT1基因的特異性激活劑，與衰老關系密切，白藜蘆醇可通過激活SIRT1基因影響關節軟骨的衰老進程。Mehta等[17]建立了老年人體外非酶糖基化誘導OA軟骨移植模型，發現白藜蘆醇在該模型中能有效抗衰老，可減緩年齡相關及糖尿病誘導的OA，并可用該模型評估年齡誘導的軟骨生物力學變化。Hecht等[18]應用內質網應激驅動的I-ERS原發小鼠OA模型證實，內質網應激可誘發關節軟骨退變，出現衰老、軟骨細胞死亡、自噬阻滯和步態功能障礙等現象，白藜蘆醇可通過降低內質網應激蛋白、TUNEL陽性軟骨細胞數量和衰老標記物p16 INK4a等的表達減緩該現象。Qin等[19]則通過研究衰老和OA中常見的細胞內穩態機制-自噬現象證實，關節內注射白藜蘆醇可以促進內側半月板失穩誘導的OA模型中軟骨自噬，這與AMP依賴的蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)信號通路密切相關。由此可知，白藜蘆醇可對非酶糖基化、內質網應激、自噬等現象產生影響進而調控調控軟骨組織及軟骨細胞的衰老。

2.2 白藜蘆醇對軟骨基質代謝的影響

軟骨遭到破壞時，基質金屬蛋白酶(MMP)、解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等酶類升高。Yi等[20]培養OA患者的軟骨細胞，經白藜蘆醇處理后進行高通量測序等檢測發現，白藜蘆醇能抑制白介素1β(IL-1β)誘導的經NF-κB通路作用的炎癥，降低MMP1/3/13和iNOS的表達，并增加II型膠原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的表達；Kang等[21]用兔軟骨細胞檢測也發現，白藜蘆醇除了能夠降低細胞中IL-1β刺激后MMP1/3/13外，同時降低了ADAMTS4/5表達，這一過程與白藜蘆醇直接作用于細胞中的NF-κB通路相關。我們團隊也發現，白藜蘆醇作用于脂多糖(LPS)誘導的小鼠膝原代軟骨細胞時，能夠降低SREBP2、MMP13的表達，起保護軟骨細胞的作用[22]。因此，白藜蘆醇可以抑制軟骨組織及軟骨細胞中造成其基質降解的酶類的表達，并促進軟骨特異性成分的分泌，而起到保護軟骨的作用。

2.3 白藜蘆醇對軟骨損傷的影響

OA等骨科疾病中，軟骨損傷已達到嚴重程度，加強對軟骨損傷的研究也有重要意義。筆者團隊的研究表明，采用微流控芯片篩選出攜載114.28 μmol/L白藜蘆醇的聚乳酸(PLA)/明膠材料比攜載其他濃度的白藜蘆醇更能夠促進大鼠膝關節軟骨缺損的修復，而且攜載100 μmol/L白藜蘆醇的PLA/明膠材料可能是通過PI3K/AKT 通路的作用促進其修復的[23-24]。Choi等[25]在體外使用白藜蘆醇處理間充質干細胞(MSCs)，增強了其增殖能力并抑制其衰老，并且提高了其軟骨生成物標記的表達，該類細胞在體內能夠促進兔骨軟骨缺損模型中透明軟骨的再生。Bonifacio等[26]構建了結冷膠-蜂蜜-硅藻復合物這種緩釋白藜蘆醇的藥物載體系統，發現該載體有利于白藜蘆醇的控釋，阻止細菌增殖和氧化應激損傷，并支持MSCs定植及朝向軟骨細胞分化。胡雄彬等[27]制備了白藜蘆醇三甲醚外用微乳凝膠，在木瓜蛋白酶注射建立的軟骨損傷新西蘭大白兔膝關節OA模型上局部外用，發現其能降低兔血清中IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達而改善關節缺損及潰瘍，促進了膝OA軟骨損傷的恢復。Chen等[28]在急性足腫脹模型基礎上用膠原誘導建立大鼠關節炎模型，發現白藜蘆醇、川芎嗪和姜黃素聯合用藥能夠減輕大鼠足腫脹及踝關節結構、軟骨、纖維組織的損傷，并且對胃無傷害，從而優于單一非甾體抗炎藥的療效。所以，白藜蘆醇結合在各種材料如聚乳酸、明膠、結冷膠、殼聚糖中形成新型復合材料后，或者與川芎嗪、姜黃素等藥物聯用，可以通過影響BMSCs的增殖分化、抑制炎癥等途徑參與軟骨損傷修復的進程。

3 白藜蘆醇對OA的作用

OA是一種多因素引起的慢性退行性疾病，多條通路參與其中，比如NF-κB[10]、TLR4[11]、ERK[12]等，白藜蘆醇可以通過激活或抑制通路中相關因子的表達，進而參與到OA中。

3.1 白藜蘆醇通過NF-κB信號通路對OA的影響

炎癥在OA中起著重要作用，而NF-κB通路是機體炎癥調節的重要通路之一。Zhang等[29]發現，OA模型中肺腺癌轉移相關轉錄本1(MALAT1)、NF-κB1、IL-6、MMP-13和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表達量升高，miR-9的表達量降低，白藜蘆醇作用后能夠逆轉這些因子的表達，認為白藜蘆醇可以通過MALAT1/miR-9/NF-κB信號通路減輕OA發生發展。Li等[30]證實，在顳下頜關節OA中，白藜蘆醇連續注射能下調環氧合酶2(COX-2)/NF-κB/MMP的表達，增加軟骨標志物，逆轉下頜髁狀突軟骨細胞的慢性炎癥，說明白藜蘆醇可通過COX-2/NF-κB途徑抗軟骨細胞凋亡及抗氧化。Jin等[31]用小鼠軟骨細胞系ATDC5進行了實驗，發現LPS能通過激活NF-κB和p38 MAPK通路抑制該細胞的活力并誘導凋亡，增加IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，白藜蘆醇預處理則降低了LPS的促凋亡及促炎癥作用，miR-146b沉默則影響了白藜蘆醇的作用，從而證實上調miR-146b導致的NF-κB和p38 MAPK通路失活是白藜蘆醇起作用的途徑。Wei等[32]認為，在大鼠OA模型中，白藜蘆醇能夠抑制TNF-α、IL-1β/6/18、Caspase-3/9、iNOS、NF-κB等的表達，并刺激血紅素加氧酶1(HO-1)和核因子E2相關因子2(Nrf-2)的表達，表明白藜蘆醇通過NF-κB和HO-1/Nrf-2通路改善OA大鼠模型中的炎癥損傷并延緩OA進展。筆者團隊也證實，經100 μmol/L白藜蘆醇預處理的小鼠軟骨細胞再受到LPS刺激時，NF-κB的核轉位受抑制，并通過該通路降低TNF-α、IL-1β的表達，降低軟骨細胞炎癥并延緩其退變[33]。因此，白藜蘆醇能夠通過NF-κB信號通路影響到OA的炎癥進程，它既能夠降低炎癥刺激時NF-κB信號通路的激活，又能夠通過該通路降低炎癥因子的表達，形成良性循環，影響OA病程。

3.2 白藜蘆醇通過TLR4信號通路對OA的影響

TLR4是參與非特異性免疫的重要因子，是單個的跨膜非催化性蛋白質。Xu等[34]研究了白藜蘆醇減輕肥胖相關的OA發生的機制，發現白藜蘆醇能降低高脂飲食小鼠OA的發生，其中TLR4和PI3K/AKT通路均被調控，初步證實白藜蘆醇可能通過激活PI3K/AKT通路進而抑制TLR4發揮抗OA作用。Jiang等[35]也研究了肥胖與OA的關系，通過灌胃給予白藜蘆醇，改善了高脂喂養小鼠的OA癥狀，血清中IL-1β和瘦素水平降低，抑制了軟骨中TLR4和腫瘤壞死因子相關蛋白6(TRAF6)表達，發現白藜蘆醇可通過降低系統炎癥水平及抑制軟骨中的TLR4通路來減輕OA病理。Ma等[11]使用白藜蘆醇二聚體Amurensin H治療碘乙酸單鈉誘導的小鼠模型發現，治療2周能顯著緩解軟骨退變及炎癥，并在細胞中發現該物質以時間和劑量依賴的方式抑制TLR4/ 脾酪氨酸激酶(Syk)通路和下游p65磷酸化和易位，闡述了Amurensin H通過TLR4/Syk/NF-κB途徑保護軟骨的作用。也有研究者使用50 μmol/L的白藜蘆醇作用后進而觀察TLR4 siRNA、PI3K抑制劑LY294002或轉錄因子叉頭框蛋白O1(FoxO1)siRNA處理過的IL-1β誘導的骨肉瘤SW1353細胞，認為白藜蘆醇作用下的SW1353細胞中存在TLR4/Akt/FoxO1炎癥自限機制，進而發揮抗OA作用[36]。Gu等[37]認為白藜蘆醇可以作為一種營養補充劑來對抗OA，他們使用IL-1β刺激的人關節軟骨細胞研究發現，白藜蘆醇可以降低該細胞活力，并導致TLR4以及與MMP13和IL-6合成相關的TLR4/髓樣分化因子88(MyD88)依賴和非依賴信號通路的下游靶點顯著上調。所以，肥胖導致關節負重增加等原因引起的OA可在白藜蘆醇的介導下通過調控TLR4信號通路得到緩解，OA本身存在的炎癥刺激及其影響下分泌的炎癥因子也可以通過該通路的作用得到緩解。

3.3 白藜蘆醇通過ERK信號通路對OA的影響

MAPK因子是能被細胞因子、神經遞質、激素等因子激活的蛋白激酶，可在所有真核細胞中表達，該通路中研究最廣的是ERK1/ERK2 (p42/p44)激酶。Shakibaei等[38]認為，白藜蘆醇和姜黃素聯用，能抑制IL-1β和MAPK途徑特異性抑制劑U0126誘導的人關節軟骨細胞凋亡以及導致β1整合素和ERK1/2的下調，進而說明兩種天然化合物能激活MEK/ERK信號通路維持軟骨細胞分化和存活。Abed等[39]則對OA中的軟骨下骨進行了研究，他們用全膝關節置換術OA患者的脛骨平臺軟骨下骨板或尸檢時正常人的脛骨平臺制備原代成骨細胞，發現白藜蘆醇能上調SIRT1表達及其活性，降低瘦素表達，增加ERK1/2磷酸化及OA成骨細胞礦化，并影響Wnt/β-catenin通路中Wnt3a的反應，說明白藜蘆醇通過ERK1/2和Wnt/β-catenin通路對OA成骨細胞表型和活性起到有益作用。He等[12]研究SIRT1基因對OA軟骨細胞凋亡和細胞外基質降解時，使用白藜蘆醇刺激細胞，降低了細胞中MMP1/13、ERK、c-Jun N-末端激酶及p38激酶表達，白藜蘆醇加用SIRT1 siRNA則逆轉這些表達，發現了SIRT1基因抑制OA軟骨細胞凋亡及細胞外基質降解的機制。Liu等[40]使用白藜蘆醇處理晚期糖基化終末產物(AGEs)刺激的豬軟骨細胞和軟骨外植體，發現白藜蘆醇抑制了AGEs刺激后細胞中炎癥因子iNOS、環氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)等的表達，并認為與KK-IκBα-NF-κB和JNK/ERK-AP-1通路相關。由此可知，ERK信號通路在白藜蘆醇緩解OA進程中也有一定作用，而這個過程與軟骨細胞的增殖、分化、表型維持，調控軟骨下骨的礦化，降低組織中炎癥因子的表達以及抑制軟骨基質的分解等密切相關。

4 小結與展望

OA與衰老、肥胖、創傷、遺傳等多因素相關，治療不及時可導致患者肢體功能障礙，甚至殘疾。該病在50歲以上人群中好發，90 %的80歲以上老年人有OA的影像學表現。隨著我國人口老齡化程度的不斷加劇，OA患者會越來越多，其造成的醫療負擔也會不斷加劇，因此加強對OA的治療迫在眉睫。白藜蘆醇是一種容易獲得的非黃酮類多酚有機天然化合物，其抗炎、抗氧化等作用可以通過影響軟骨衰老、軟骨基質代謝、軟骨損傷等作用參與OA的進程，這一過程可能與NF-κB、TLR4、ERK等信號通路相關。但在以往的研究中，學者更多的是關注白藜蘆醇單藥對軟骨組織某功能的單一影響、從而解釋白藜蘆醇對軟骨破壞的影響進而延伸到OA的進程中，缺乏從軟骨到軟骨下骨整個層面的宏觀解釋以及軟骨衰老、基質代謝和損傷等多功能層面的闡述，并且多數研究只通過單一的經典信號通路闡述白藜蘆醇在OA發病機制中的作用，造成了片面性。筆者認為，從整體角度及多功能層面出發，將白藜蘆醇負載于生物活性材料中，或者在添加白藜蘆醇的同時聯合其他藥物或基因層面的改變、并結合單細胞測序或高通量測序等新興技術研究白藜蘆醇對OA的影響及機制，或許是一個可行的新出發點。鑒于此，加強白藜蘆醇對OA治療的研究，可能有利于為臨床治療OA提供潛在藥物，最終造福于患者。