3D細胞培養和類器官在骨髓源性間充質干細胞成骨分化中的研究進展

周子墨 柳達 陳森相 覃森

中國醫科大學附屬盛京醫院骨科，遼寧 沈陽 110004

骨髓源性間充質干細胞(BMSCs)是一類具有多向分化潛能的干細胞，根據誘導方式的不同，可以分化為神經元、軟骨細胞、成骨細胞等[1-3]。當骨組織發生損傷后，損傷部位釋放的因子誘導遠處的BMSCs向損傷部位遷移，發生歸巢效應，并定植于損傷部位。同時，BMSCs不斷分化為成骨細胞，并釋放多種細胞因子，促進新的骨組織生成，這一過程也被稱為成骨分化(osteogenesis differentiation)[4]。因此，BMSCs的骨組織修復作用機制可分為3個方面：①多向分化；②旁分泌；③歸巢效應。近年來，BMSCs的成骨分化在骨質疏松癥、骨折、骨肉瘤等多種疾病中發揮重要作用，其相關的多種分子機制也不斷被闡述[5-6]。

隨著對干細胞研究的不斷深入，大量研究已經證明干細胞可以沿著特定的組織譜進行自我增殖和分化。此外，從體內分離并在體外培養的干細胞在誘導下可以分化為特定的細胞，這為體外器官的構建提供了基礎。近年來，3D培養技術的不斷成熟，使得多種干細胞及腫瘤相關類器官模型被構建，這些模型具有構建所需時間短、遺傳學穩定等特點，可以很好地還原相關疾病在體內的發生發展和分子遺傳學特性，為研究疾病發病及其相關分子調控機制提供了很好的基礎[7]。BMSCs作為一類多能分化干細胞，其潛在的體外增殖和分化能力受到關注。目前，對BMSCs的成骨分化研究主要集中在2D細胞培養，而這種簡單的體外培養方式無法構建骨組織及機體內環境，極大限制了BMSCs的成骨分化研究。3D培養技術的發展使得BMSCs成骨分化相關類器官的構建成為可能，這一技術有望在骨質疏松癥等骨代謝性疾病的發病機制研究、分子治療、藥物研發及組織工程等領域發揮重要作用。

1 類器官定義及發展

1.1 類器官的定義

早在1975年，Rheinwald等[8]通過角化細胞和3T3成纖維細胞的共培養，構建了類似于表皮的分層鱗狀上皮細胞集落。近年來，隨著3D培養技術的發展，類器官也被進一步描述為模仿哺乳動物原始組織的體內結構和多譜系分化干細胞形成的具有一定組織形態的三維結構[9]。3D培養技術模擬了干細胞生長所需的細胞外基質環境并提供了懸浮細胞培養條件，這一人工構建的微環境與體內微環境相似，包含多種與干細胞生物學行為相關的細胞及細胞因子等。干細胞在這一環境中受到微環境的調控，模擬在機體內發生的一系列生物學過程，并逐漸被誘導分化形成特定的、能夠自組織的三維結構，這一特定組織結構也被稱為干細胞龕(stem cell niche)，即類器官。類器官的構建及相關實驗方式兼備了普通細胞培養、干細胞異體輸注培養和自體組織切片的優點，為干細胞及腫瘤研究提供了更加靈活的手段。

1.2 類器官的發展

類器官在多種干細胞及腫瘤研究中發揮了重要的作用。Sato等[10]第一次通過在體外構建類器官培養環境，使得腸成體干細胞(ASCs)在類器官中穩定并自組織的形成隱絨毛類器官。在此基礎上，研究人員制備出了多種組織的類器官，包括腸道、腎臟、肝臟、胃、肺等[7,11-14]。這些類器官均由不同類型的干細胞分化而來，如2013年，Takebe等[15]誘導多能干細胞(iPSCs)分化為肝臟類器官并移植入腸系膜，極大緩解了肝衰竭的進程。此外，胚胎干細胞(ESCs)可以誘導產生肺和腦等類器官[9,16]。干細胞的多能分化作用還體現在同種多能干細胞可分化為不同的類器官，如ASCs不僅可以分化為腸道類器官，還可以分化為肝臟、胰腺、肺等[17-19]。這也提示類器官的構建對3D培養環境的要求較高，適合的培養條件及環境對干細胞誘導極其重要。2005年，Braccini等[20]第一次描述了一種針對BMSCs的3D培養系統，可直接在3D環境中種植和分化BMSCs，其成骨效果較2D培養的BMSCs更好。

目前，除了構建不同組織的類器官，與類器官培養相關的技術也在不斷發展。針對不同細胞類型的不同組織類器官，培養方案均有較大差異。針對乳腺癌的類器官培養，研究者將組織樣本進行機械破壞和酶消化結合方法，制定了基礎的培養方案。在此基礎上，實驗方案不斷被優化，多種生物制劑被應用于乳腺癌的類器官的構建，大大提高了培養的成功率[21]。Wu等[22]發現在3D培養系統中提供合適的軟骨微環境，如軟骨細胞外基質后可以促進BMSCs的軟骨分化。此外，對于3D培養使用的材料，也在不斷發展。一種基于骨骼肌袋的生物材料培養系統被開發，用來支持干細胞的長期培養，并構成了一種新的類器官模型，為骨組織移植提供了可能[23]。

2 BMSCs成骨分化相關類器官的培養

類器官的3D培養環境對于其模型構建至關重要。類器官的自組織指干細胞在3D培養環境中從最初一個缺乏有序的結構，在系統性自主調控機制的指導下，進行空間重新排列的過程。自組織過程可分為兩個階段，一個是包括反應擴散機制、調控網絡的雙穩定性機制和不對稱細胞分裂機制構成的自我模式(self-patterning)，主要由局部細胞間通訊介導；另一個是包括組織內不同類型細胞的聚類和更高層次的結構重組導致的類器官形態重排。自組織中，細胞的粘附作用、細胞運動、細胞形態和細胞間信號串擾(crosstalk)均發揮了重要的作用[24]。這一過程的影響因素可以概括為：①培養環境的理化特性；②系統內源和外源信號。

2.1 培養環境的理化特性

類器官的3D培養所需要的容器必須能支持細胞粘附和生長，一種從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提純獲得的基質膠(Matrigel)被作為細胞外基質廣泛應用于3D培養中[9]。對于BMSCs的分化培養，有研究表明，相比于單純涂有細胞外基質的藻酸鹽微珠培養系統，添加有硫酸軟骨素 (CS) 和 Col 2的培養體系可以更好的促進BMSCs的軟骨分化[22]。

水凝膠作為一種新的生物材料，也被認為是Matrigel的替代品，其可以控制培養環境的理化特性及力學特性，并在BMSCs的成骨分化和類骨組織形成中發揮作用[25-27]。但水凝膠對于BMSCs的內器官形成作用依然有爭議。傳統基質中含有IGF、TGF/組織纖溶酶原激活物等復雜的生長因子，而水凝膠中則缺乏這些天然含有的生長因子[14]。Jaramillo等[28]將BMSCs加入合成水凝膠基質 (PEGDA)并植入成年雄性Lewis大鼠的回腸系膜，以期形成類牙齒器官，但由于缺乏基質相互作用，BMSCs無法和PEGDA相容。

此外，還有多種生物3D支架也被廣泛開發用于BMSCs的體外3D培養[29-30]。Lastra等[31]開發了一種全新的由富馬酸-醋酸乙烯酯共聚物和殼聚糖制備的微球環境，不僅可以促進BMSCs增殖，還可以促進其重新排列成簇生長，表明出良好的類骨組織生長。Abbasi等[32]構建了一種機械調節劑聚合物微粒MP，這種微粒使得人間充質干細胞(human mesenchymal stem cell，hMSCs)球體不斷增殖和成骨分化，成為一類成骨分化類器官建模的新工具。

2.2 系統內源和外源信號

類器官的自組織需要多種細胞因子及信號的刺激。首先是由干細胞自分泌和旁分泌產生的內源信號，如外泌體、生長因子等。當干細胞聚集生長時，這些干細胞分泌出多種因子，激活并刺激更多干細胞的分化過程。一些類器官的產生幾乎完全依賴于內源信號，例如，小鼠PSCs培養而來的小鼠視杯類器官需要在低生長因子水平的無血清培養基中培養，而PSCs自己產生的內源信號對視杯類器官的產生起到決定作用[33]。對于BMSCs的研究中我們發現，3D培養時，BMSCs分泌的外泌體可以激活周圍BMSCs的HMGB1/AKT通路，從而對BMSCs的增殖、遷移影響較2D培養更強[34]。

其次，類器官自組織所需的外源信號包括外界給予的多種細胞因子和生長因子。在3D培養所提供的血清中，已含有一定量的生長因子，此外，BMSCs成骨分化所需要的抗壞血酸、β-磷酸甘油及一定劑量地塞米松等也會被添加入培養基中。Petrigliano等[35]在涂有成纖維細胞生長因子 (bFGF)的3D支架上培養BMSCs。實驗表明，額外提供bFGF可以很好的促進BMSCs的生長分化。此外，一些研究通過在基質膠中加入Col I等促成骨分化因子，以進一步促進成骨分化的發生[36]。

在最初的增殖與分化中，外源信號發揮著重要作用，通過外源信號的刺激，內源性信號被激活，并發揮調控作用。因此，內源信號與外源信號在類器官的構建中均發揮了不可或缺的作用，這也為BMSCs成骨分化類器官提供了更多的研究方向，如改變外源信號的水平或者使用藥物干擾內源信號的表達對類器官模型的影響及其相關分子機制[37]。

3 BMSCs成骨分化相關類器官的應用

目前，針對BMSCs的類器官構建依然較少。BMSCs的3D培養主要應用于組織工程和植入材料的開發，如優化的絲素蛋白明膠支架、透明質酸水凝膠支架等在BMSCs的軟骨分化中可以起到促進作用，為軟骨原位修復提供更多可能[26,38]。目前一些研究已經證實這些無機或有機材料制備的3D支架可以通過自身的特性，如接近機體骨骼的礦物質百分比、組成、結構以及力學性能，提供適合BMSCs生長的理化特性，以促進BMSCs的增殖、分化，這也為類器官的構建提供了很好的基礎[39]。

臨床上，已有研究通過3D培養技術構建牙齒及顱面骨的類器官，使得移植物在受損的顱面組織上移植后，能促進牙槽骨再生和頜骨重建，這種類器官的移植最適合由創傷、疾病或出生缺陷引起的口腔骨、皮膚和牙齦嚴重缺損，并在臨床治療中得到了較好的預后[40]。

而在其他如藥物篩選和骨質疏松癥疾病的基礎研究等領域，3D培養更體現出優于2D細胞培養的特點。有研究通過3D培養構建牙周韌帶間充質干細胞 (PDLSCs)團塊，討論脂多糖(LPS)對間充質干細胞增殖和成骨潛能的影響研究。結果表明，相較于2D平面培養的3D PDLSCs，3D培養的PDLSCs團塊更能抵抗LPS的作用，降低炎癥反應的發生[41]。此外，與2D塑料板上培養的MSCs相比，3D浮動培養的MSCs團塊中環氧合酶2 (COX2)介導的PGE2產生顯著增加，并且顯著抑制了細胞的凋亡[42]。目前，針對MSCs的3D培養構建肝臟類器官模型并進行藥物篩選及移植的研究已被廣泛開展，但對于BMSCs成骨分化類器官的研究，依然十分有限。

4 總結與展望

3D細胞培養技術作為一種新的細胞培養手段，由于可以提供細胞生長所需的細胞外基質環境及懸浮細胞培養條件，使得其能更接近于人體的微環境。而干細胞的多向分化能力、旁分泌和歸巢效應，則為3D培養及類器官模型的建立成為可能。因此，類器官模型的建立在生物醫學領域有著廣闊的應用前景。盡管BMSCs成骨分化的類器官模型已被構建并不斷優化，且被應用于臨床，但其依然存在許多限制。首先是與傳統BMSCs培養相比，3D細胞培養過程較復雜，所需耗材昂貴，且技術不成熟等因素導致類器官構建成功率較低。此外，人體BMSCs的獲得和擴大培養較困難，其涉及到的倫理問題也使得這一技術無法在大規模的藥物篩查及基礎實驗中被利用。解決以上問題，還需要更深入的研究。

綜上所述，BMSCs成骨分化的3D細胞培養及類器官的構建可以應用于骨質疏松癥等多種疾病的藥物篩查、基礎研究及臨床治療相關的組織工程中。其特有的優勢可以幫助研究人員更深層次的探討BMSCs成骨分化相關機制與藥物治療，使骨代謝疾病的個體化治療成為可能。