多重實時熒光串聯PCR技術高通量檢測生蠔中9種致病菌

麻春陽，高世玨，蔣麗婷，楊礎華，TANUSHREE B GUPTA，NIMA AZARAKHSH，吳希陽*

1(暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)2(廣州市微生物研究所有限公司，廣東 廣州，510663) 3(梅西大學Hopkirk研究所，新西蘭 北帕默斯頓，4474)

食源性致病菌是影響食品安全最主要的因素之一。大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌、單增李斯特菌和創傷弧菌都是即食食品中廣受關注的食源性致病菌，常引起急性胃腸炎，并伴有惡心、頭痛、低熱，嚴重時可造成死亡[1-2]。由于這9種致病菌可同時長期存活于水體環境中，增加貝類產品在養殖過程中致病菌污染的可能性，進而在人群食用過程中產生食物中毒[3]。因此建立一種可靠的、針對這9種致病菌檢測的快速方法，對于食品安全、健康和民生都有重要意義。

目前已有關于貝類產品中食源性病毒(如諾如病毒)快速檢測的報道[4-5]，但尚缺乏生蠔中大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、產氣莢膜梭菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌和創傷弧菌的高通量檢測手段的研究。傳統基于選擇性培養基和生化分析的方法檢測這9種致病菌，具有檢測程序復雜、耗時長的缺點，并且可能會因方法的低靈敏度和低特異性導致大量的錯檢[6-7]。過去10年，基于傳統PCR的方法發展迅速，該方法具有分析時間短，節省人力等優點[8]。

多重實時熒光串聯PCR(multiplexed tandem PCR，MT-PCR)結合了多重PCR、巢式PCR和熒光定量PCR技術，可實現對食源性致病菌的高通量快速檢測。該方法針對一個靶基因設計內、外2對引物，首先使用混合的外引物，進行一個循環數較少的高通量多重富集PCR，然后將第一輪多重富集PCR的產物用ddH2O稀釋作為第二輪的模板，其次再使用內引物進行第二輪巢式熒光定量PCR，結果根據擴增曲線和熔解曲線分析。基于此原理，MT-PCR已被應用于檢測臨床樣品中的病毒[9]、真菌[10]和轉基因食品[11]。

本研究通過設計特性引物、優化MT-PCR參數，建立了一種可同時檢測以上9種致病菌的方法，并將該方法用于檢測人工染菌的生蠔樣品，評價了該技術的定量能力和檢測靈敏度，為快速檢測貝類產品中食源性致病菌提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌種

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，暨南大學食品科學與工程系，創傷弧菌(Vibriovulnificus)、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)，廣東省微生物菌種保藏中心，9株目標菌株用于建立MT-PCR方法。

表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、化膿性鏈球菌(Staphylococcuspyogenes)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、腸道沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、霍利斯弧菌(Vibriohollisae)、擬態弧菌(Vibriomimicus)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、普雷沃氏菌(Prevotellamelaninogenica)、嗜黏蛋白阿克曼菌(AkkermansiaMuciniphila)、英諾克李斯特菌(Listeriainnocua)、威爾氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、溶血鏈球菌(Streptococcushaemolyticus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)保存于暨南大學食品科學與工程系，19株非目標菌株用于MT-PCR特異性檢驗。

實驗采用的人工污染貝類產品為生蠔，廣州水產市場。

1.1.2 試劑與儀器

營養瓊脂(nutrient agar medium，NA)、腦心浸出液(brain heart infusion，BHI)、3% NaCl堿性蛋白胨水(alkaline peptone water，APW)、胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂基礎(tryptone-sulphite-cycloserine，TSC)、液體硫乙醇酸鹽培養基(fluid-thioglycollate，FT)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptose soya agar，TSA)，廣東環凱微生物科技有限公司；DP302細菌基因組DNA提取試劑盒、DP324海洋動物基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；Multiplex PCR Assay Kit Ver.2、TB Green Premix DimerEraser，大連寶生物科技有限公司。

C1000梯度PCR儀，德國Eppendorf公司；X3FR高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技有限公司；Stepone Plus熒光定量PCR系統，美國應用生物系統有限公司；LS-400無菌均質器，上海比隆儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的培養及模板DNA提取

弧菌菌株在含3%NaCl的TSA平板上活化，梭菌、厭氧菌株在TSC平板上活化，其他的好氧菌株在NA平板上活化，所有菌株活化后，挑單菌落接種于液體培養基，厭氧菌放置于厭氧盒中37 ℃過夜培養，好氧菌于37 ℃，120 r/min恒溫振蕩培養箱中過夜培養。9種目標菌株過夜培養后分別取1 mL菌液，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，按照說明書進行，將DNA模板凍存于-20 ℃備用。

1.2.2 內外引物的設計與合成

使用primer primmer V5.0，分別針對大腸埃希氏菌的uidA基因、金黃色葡萄球菌的Nuc基因、沙門氏菌的STM4497基因、溶藻弧菌的gyrB基因[12]、副溶血弧菌的collagenase基因[12]、銅綠假單胞菌的ecfX基因[13]、單增李斯特菌的ORF2819基因，創傷弧菌的vvhA基因[12]和產氣莢膜梭菌的plc基因[14]進行內外引物篩選，部分序列參考已有文獻，所有引物序列經NCBI-BLAST比對分析，以評估產生交叉反應的可能性。驗證后的所有引物(表1)由擎科生物科技有限公司合成。

表1 MT-PCR的內引物和外引物Table 1 Outer and inner primer of MT-PCR

續表1

1.2.3 MT-PCR反應體系的建立與優化

第一輪多重富集PCR反應體系：25 μL mix 2，1 μL mix 1，4.8 μL各基因外引物混合液和2 μL DNA模板混合液，用ddH2O調整體積至50 μL。反應條件為：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s，10～20個循環；72 ℃ 10 min。

將第一輪多重富集PCR產物用ddH2O稀釋(10～100倍)作為第二輪實時熒光定量PCR的模板，每孔體系為：10 μL TB mix，2 μL第一輪PCR產物稀釋液，0.4 μL各基因的內引物，0.4 μL ROX，用ddH2O調整體積至20 μL。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環，每個循環在72 ℃結束后檢測熒光信號；反應結束后進行熔解曲線分析：65～95 ℃，每0.5 ℃掃描熒光一次。

此外，分別對9種目標菌種的DNA進行單獨的內引物實時熒光定量PCR(qPCR)擴增，作為對照組。qPCR的反應程序與MT-PCR第二輪程序及體系一致。

1.2.4 MT-PCR特異性與靈敏度評價

利用9對特異性引物與9種目標菌株和19種非目標菌株的基因組DNA分別進行正交測試，以驗證MT-PCR體系的特異性。

分別培養9種目標菌株至同一數量級，等比例混勻后按照10倍梯度稀釋，經試劑盒提取DNA后再分別采用MT-PCR和qPCR進行檢測并建立標準曲線以對比2種方法的靈敏度。

1.2.5 MT-PCR檢測人工污染貝類產品

將生蠔組織剪碎、均質，稱取均質樣品25 mg，紫外照射30 min，再將樣品分別浸泡于10倍梯度稀釋的混合菌液中，染菌后樣品經海洋動物基因組DNA提取試劑盒提取模板DNA，按照1.2.3步驟進行檢測，評價MT-PCR在檢測水產樣品中的定量能力和靈敏度。

2 結果與分析

2.1 多重MT-PCR的優化結果

第一輪循環數優化結果如圖1-a所示，當第一輪循環數為10～15個循環，其閾值循環數(cycle threshold,Ct)值大于或接近qPCR所得Ct值，說明其靈敏度低于qPCR；當第一輪循環數為20個循環，MT-PCR針對9個目標菌的Ct值小于qPCR對應所得Ct值，且9個目標菌株所對應的Ct值為15左右，MT-PCR方法優于qPCR方法。

a-第一輪反應循環數的優化；b-第一輪產物稀釋倍數的優化圖1 MT-PCR的優化Fig.1 The optimization of MT-PCR

對第一輪反應的產物分別稀釋10、50、100倍，用作于第二輪實時熒光定量PCR的模板。結果如圖1-b所示，稀釋倍數為50、100倍時，MT-PCR擴增所得Ct值高于或接近qPCR，熔解曲線為單峰，稀釋倍數為10倍時，其Ct值低于qPCR，且9個目標菌株所對應的Ct值為15左右，溶解曲線為單峰，無非特異性擴增。

因此，在對MT-PCR的優化過程中，為保證MT-PCR的擴增優勢，選擇第一輪的循環數為20個循環，第一輪擴增產物的稀釋倍數為10倍，作為MT-PCR反應的條件，并用于后續實驗。

2.2 多重MT-PCR的特異性評價

28株菌株的DNA分別與9對引物的MT-PCR正交反應，特異性結果如表2所示，MT-PCR檢測9種目標菌株時，只有其對應的目標基因經MT-PCR擴增，結果顯示陽性，非目標基因檢測結果顯示陰性。

表2 MT-PCR 特異性分析Table 2 The specificity of MT-PCR

其中19種非目標菌株的DNA分別與9對引物的MT-PCR反應，結果均顯示陰性，未檢測到擴增，表明MT-PCR反應體系中的引物序列針對非目標菌株時無非特異性擴增及自身無交叉反應，即本研究建立MT-PCR方法特異性強。

2.3 多重MT-PCR體系靈敏度評價

10倍梯度稀釋9種食源性致病菌的混合液，提取相應的基因組DNA，同時進行MT-PCR和qPCR檢測以對比2種方法的定量能力和靈敏度。結果如圖2所示，2種方法的標準曲線線性關系良好，R2均>0.98，擴增效率在90%～110%。MT-PCR針對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、產氣莢膜梭菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌和創傷弧菌的檢測限為102～104CFU/mL，相比qPCR的檢測定量限均低一個數量級。而針對沙門氏菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌，MT-PCR和qPCR的檢測定量限一致，為102～103CFU/mL，說明MT-PCR對DNA模板的預擴增具有一定優勢。

a-E.coli；b-S.aureus;c-Salmonella;d-V.alginolyticus;e-V.parahaemolyticus;f-C.perfringens;g-P.aeruginosa;h-L.monocytogenes;i-V.vulnificus圖2 MT-PCR和qPCR檢測9種食源性致病菌在培養菌液中的靈敏度Fig.2 The sensitivity of MT-PCR and qPCR for detecting 9 foodborne pathogens in pure culture

2.4 多重MT-PCR在人工染菌生蠔樣品中的應用

10倍梯度稀釋9種食源性致病菌的混合液，人工染菌至生蠔組織上，提取基因組DNA進行MT-PCR擴增。如圖3所示，MT-PCR至少可檢測該樣品中1.65×102CFU/g的大腸埃希氏菌、3.95×103CFU/g的金黃色葡萄球菌、6.58×102CFU/g的沙門氏菌、3.70×103CFU/g的溶藻弧菌、1.62×103CFU/g的副溶血弧菌、1.36×102CFU/g的產氣莢膜梭菌、8.24×102CFU/g的銅綠假單胞菌、1.83×103CFU/g的單增李斯特菌以及1.09×102CFU/g的創傷弧菌。因此，MT-PCR在生蠔樣品中應用的檢測限范圍為102～103CFU/g。

3 結論與討論

MT-PCR方法作為一個開放的檢測系統，可通過增加靶基因的數量來實現高通量檢測，但這同時也會導致引物的非特異性結合，因此設計并篩選出合適的引物是保證方法特異性和靈敏度的關鍵。研究表明，實時熒光定量PCR產物長度小于200 bp有利于MT-PCR檢測[15]，因此本研究在設計內外引物時控制外引物長度在90～200 bp，內引物長度在60～110 bp。此外，所有的內外引物均針對本研究中9個目標菌株的特異性序列，MT-PCR針對目標菌株和非目標菌株的檢測結果顯示出了100%的選擇性和特異性。

第一輪較少的循環數可以確保目標基因得到預擴增的同時有效避免引物的競爭和底物的消耗。在本研究中，第一輪反應循環數為20，稀釋倍數為10倍時，MT-PCR針對9種目標菌株所得的Ct值最小，比qPCR有更強的檢測信號。MT-PCR較高的靈敏度與其預擴增步驟相關性較大，而本研究建立的MT-PCR方法對6種菌株的檢測定量限(102～104CFU/mL)均低于qPCR(103～105CFU/mL)也說明了這一點。COSTA等[16]的研究也出現了類似結果，其使用單管巢式實時熒光定量PCR檢測榛子中的過敏原，結果顯示該方法的靈敏度比普通qPCR高10倍。此外，本研究建立的MT-PCR技術的靈敏度與其他研究利用多重PCR檢測致病菌所得的檢測靈敏度具有一定的可比性。TAO等[17]基于通用引物建立的多重PCR檢測單增李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和產氣莢膜梭菌，靈敏度在103～104CFU/mL。

a-E.coli；b-S. aureus;c-Salmonella;d-V.alginolyticus;e-V.parahaemolyticus;f-C.perfringens;g-P.aeruginosa;h-L.monocytogenes;i-V.vulnificus圖3 MT-PCR檢測人工染菌生蠔樣品中的9種食源性致病菌的靈敏度Fig.3 The sensitivity of MT-PCR for simultaneously detecting 9 foodborne pathogens in oyster

D’SOUZA等[18]使用qPCR可檢測含有102CFU/g創傷弧菌的蛤蜊。ZHANG等[19]使用多重實時熒光定量PCR可檢測含102CFU/g副溶血弧菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的對蝦樣品。本研究建立的MT-PCR方法可同時檢測人工染菌生蠔中的9種致病菌，靈敏度為102～103CFU/g。說明本研究建立的MT-PCR方法在實現高通量檢測的同時具有較高靈敏度。

因此，本研究建立的MT-PCR方法可用于同時檢測9種病原菌，具體包括大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、產氣莢膜梭菌、銅綠假單胞菌和創傷弧菌，該方法靈敏度高、特異性強，且擁有比qPCR更優或相當的定量能力。此外，MT-PCR還適用于同時檢測生蠔樣品中多種食源性致病菌，在高通量快速檢測領域具有廣闊的應用前景。