發(fā)酵動(dòng)物性食品來(lái)源生物活性肽研究進(jìn)展

胡峣峣，肖珊,*，王波，蔡燕雪，王際輝,*

1(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034)2(東莞理工學(xué)院 化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院，廣東 東莞，523808)

發(fā)酵食品是指利用有益微生物或酶的作用，使加工原料發(fā)生有益的物理或化學(xué)變化而制得的一類食品，在人類的飲食文化中占有重要地位。動(dòng)物性食品包括畜禽肉、蛋類、水產(chǎn)品、奶制品等。發(fā)酵動(dòng)物性食品是以動(dòng)物性食品為主要原料，在自然或人工控制條件下，利用微生物的發(fā)酵或酶的水解作用使原料發(fā)生一系列生物化學(xué)變化及物理變化，從而形成風(fēng)味、色澤和質(zhì)地獨(dú)特且具有較長(zhǎng)保質(zhì)期的食品，主要包括奶酪、發(fā)酵乳、干腌火腿、發(fā)酵香腸、發(fā)酵酸肉、魚露、發(fā)酵魚肉等。動(dòng)物性食品蛋白含量豐富，在發(fā)酵過(guò)程中微生物的蛋白水解系統(tǒng)可以直接分泌產(chǎn)生大量蛋白酶，將蛋白質(zhì)降解為小分子多肽。研究表明，這些小肽(活性肽)具有抗氧化、降血壓、降血脂、抗疲勞以及免疫調(diào)節(jié)等一系列生理功能[1]，其功能活性與氨基酸的組成、序列、分子質(zhì)量、電荷和空間構(gòu)象等有關(guān)。研究證實(shí)，經(jīng)口服攝入活性肽后，部分在消化道內(nèi)發(fā)揮一定的生理功能，部分可完整通過(guò)腸上皮細(xì)胞，吸收入血后通過(guò)免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等發(fā)揮生理功能[2]。本文探討了發(fā)酵動(dòng)物性食品中生物活性肽的來(lái)源、分類、分離提純、結(jié)構(gòu)分析方法以及產(chǎn)生機(jī)理，以期為進(jìn)一步挖掘發(fā)酵動(dòng)物性食品來(lái)源生物活性肽提供參考。

1 發(fā)酵動(dòng)物性食品來(lái)源生物活性肽的生理功能

生物活性肽(bioactive peptide, BAP)是指對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類分子。生物活性肽是氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成的，結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，小到只有2個(gè)氨基酸，大到復(fù)雜的長(zhǎng)鏈或環(huán)狀多肽，并可通過(guò)糖基化、磷酸化或酰基化而被修飾[3]。目前，在發(fā)酵動(dòng)物性食品中發(fā)現(xiàn)的生物活性肽主要有抗高血壓、抗氧化、抗菌、抗炎、抗血栓、降低膽固醇等功能特性[4]。表1列舉了近年來(lái)發(fā)酵動(dòng)物性食品的種類、優(yōu)勢(shì)菌群及其產(chǎn)生生物活性肽的種類、來(lái)源、氨基酸序列等。

1.1 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)會(huì)將血管緊張素型轉(zhuǎn)化為Ⅰ型、轉(zhuǎn)化為Ⅱ型，ACE抑制肽可抑制轉(zhuǎn)化酶的活力，從而起到預(yù)防或治療高血壓的作用。目前，在奶酪、發(fā)酵乳、火腿、發(fā)酵魚等發(fā)酵動(dòng)物性食品中發(fā)現(xiàn)了具有抗高血壓活性的生物活性肽[5-7]。

1.2 抗氧化肽

抗氧化肽是指能夠清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、螯合過(guò)渡金屬離子和降低細(xì)胞自氧化速率，并且能夠有效捕獲并中和自由基的一類活性物質(zhì)。在酸奶、火腿、奶酪、蝦醬等發(fā)酵動(dòng)物性食品中已經(jīng)被分離出多種抗氧化肽，且具有生物活性高和毒性低等優(yōu)點(diǎn)[8]。抗氧化肽是目前食源性天然產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前在多肽數(shù)據(jù)庫(kù)(BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù))已知的3 285個(gè)肽段中，抗氧化肽占比最高，約為16.1%[9]。發(fā)酵動(dòng)物制品中含有豐富的抗氧化肽，其形成機(jī)理和加工條件對(duì)抗氧化肽形成的影響研究相對(duì)較少。

1.3 降血糖肽

目前臨床上常用于控制血糖和預(yù)防糖尿病的藥物中包含二肽基肽酶IV抑制劑(DPP-IV)類藥物[10-11]，降血糖肽就是作為DPP-IV抑制劑進(jìn)而發(fā)揮降低血糖作用的[6]。目前對(duì)于天然食品源降糖肽研究較少，特別是發(fā)酵動(dòng)物性食品中降糖肽鮮有報(bào)道，發(fā)酵動(dòng)物性食品含有豐富的肽類物質(zhì)，有關(guān)降糖肽的提取分離、結(jié)構(gòu)表征及其降糖機(jī)制等方面的研究有待進(jìn)一步深入。

1.4 抗菌肽

抗菌肽是指具有一定抗菌、抗病毒和抗真菌活性的小分子蛋白質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)具有兩親性，一般帶正電荷[12]。發(fā)酵動(dòng)物性食品中含有大量細(xì)菌或真菌的發(fā)酵產(chǎn)物，這些發(fā)酵產(chǎn)物中抗菌肽含量豐富，天然食品來(lái)源的抗菌肽毒性低，可應(yīng)用于研發(fā)食品防腐劑和抗生素替代品，具有廣泛的應(yīng)用前景[13-14]。但目前關(guān)于發(fā)酵動(dòng)物性食品中抗菌肽的研究較少，抗菌肽的結(jié)構(gòu)組成和抗菌機(jī)理尚不明確。

1.5 抗炎肽

抗炎肽是機(jī)體通過(guò)綜合調(diào)控細(xì)胞炎癥因子的分泌、炎性介質(zhì)合成與釋放和炎癥信號(hào)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)的一類小分子肽，一般由2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。小分子肽通常在完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不能發(fā)揮其生物活性，而經(jīng)過(guò)酶解或在酸堿等極端條件下被釋放出來(lái)時(shí)才會(huì)表現(xiàn)出其特定的生理活性[15]。發(fā)酵動(dòng)物性食品蛋白含量高，是抗炎肽的良好來(lái)源[16-17]。目前發(fā)酵動(dòng)物性食品中抗炎肽的研究相對(duì)較少，這些肽如何產(chǎn)生與釋放，是否可進(jìn)入細(xì)胞，以及其如何介導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)有待深入研究。

表1 發(fā)酵動(dòng)物性食品來(lái)源生物活性肽的種類及氨基酸序列Table 1 Summary of the type and amino acid sequences of bioactive peptides from animal-derived fermented foods

2 生物活性肽的制備與提取

多肽的制備和提取方法較多，各有利弊，可以通過(guò)對(duì)多肽性質(zhì)的研究?jī)?yōu)化提取方法，進(jìn)而獲得高活性、高純度和大批量的生物活性肽。目前從發(fā)酵動(dòng)物性食品中獲取生物活性肽的方法主要包括蛋白酶水解、浸取、雙水相萃取等。酶解法制備生物活性肽的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)工藝成本低、化學(xué)試劑和毒性物質(zhì)殘留少，目前廣泛應(yīng)用于生物活性肽的制備工藝中。酶解蛋白常用的酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶以及木瓜蛋白酶等。祝超智[28]用胃蛋白酶、胰酶等消化酶對(duì)金華火腿抗氧化肽進(jìn)行酶解提取，分析比較了酶解前后肽段的抗氧化活性差異，結(jié)果表明酶解后分子質(zhì)量更小的肽段具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

雙水相萃取技術(shù)(aqueous two-phase extraction,ATPS)與液相萃取技術(shù)原理相似，都是利用目標(biāo)物在兩水相的溶解度不同，導(dǎo)致分配系數(shù)存在差異而對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離的技術(shù)[33]。在雙水相系統(tǒng)中，兩相的水分都在85%～95%左右，且成相的高聚物與無(wú)機(jī)鹽都是生物相容的，這一新型分離技術(shù)的特點(diǎn)是生物活性物質(zhì)或細(xì)胞在這種水相環(huán)境下，它們不僅不會(huì)喪失活性，而且還會(huì)提高穩(wěn)定性，在生物分離技術(shù)領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。目前采用雙水相萃取技術(shù)從發(fā)酵動(dòng)物性食品中提取生物活性肽還未見報(bào)道，但有采用該方法從乳清分離蛋白中分離出生物活性肽的報(bào)道[34]。雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用的難點(diǎn)在于雙水相體系的構(gòu)建，利用新的雙水相體系對(duì)生物活性肽進(jìn)行分離純化的開發(fā)過(guò)程較為繁雜，但該方法對(duì)于生物活性肽的大批量分離純化具有重要意義。

3 生物活性肽的分離純化及結(jié)構(gòu)分析

3.1 分離純化

生物活性肽的分離純化是其生物活性研究與結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)，通常會(huì)根據(jù)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性、酸堿性等理化性質(zhì)的不同，選擇合適的分離純化方法。同時(shí)，多維色譜組合，以及多種分離方法聯(lián)用，可以獲得更好的分離效果。發(fā)酵動(dòng)物性食品中研究比較多的是發(fā)酵肉制品和發(fā)酵乳制品，從這些產(chǎn)品中分離純化生物活性肽通常采用超濾、凝膠層析色譜、離子交換色譜以及各方法與反相液相色譜的聯(lián)用等。

忽曉平[35]利用孔徑分別為3 k、10 kDa的超濾膜分離金華火腿粗肽，得到2種不同分子質(zhì)量的多肽組分，并且分子質(zhì)量<3kD的金華火腿小肽的抗氧化活性顯著高于粗肽。柯義強(qiáng)[36]使用Sephadex系列凝膠將發(fā)酵法制備的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽按照分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離，將超濾后的組分依次經(jīng)過(guò)凝膠SephadexG-50、SephadexG-25和SephadexG-10，其中經(jīng)SephadexG-25凝膠過(guò)濾層析后的組分F1，再經(jīng)過(guò)SephadexG-10凝膠層析后，其抗氧化能力顯著提升。邢路娟[27]采用陰離子交換柱(HiPrep 16/10 DEAE)為固定相，用0～100% NaCl與磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，以2 mL/min的洗脫速度成功將宣威火腿中抗氧化肽組分分離出來(lái)。PIOVESANA等[37]采用反相高效液相色譜分離與柱后添加增壓劑相結(jié)合的方法分離小分子多肽，以多孔石墨碳作為固定相，極大增加了極性分子和離子在固定相中的保留時(shí)間，從而可以更有效地分離純化極性高的多肽[37]。在實(shí)際應(yīng)用中，單一的分離方法往往不能達(dá)到良好的分離效果，將多種分離方法進(jìn)行組合可以得到高純度高活性的多肽，例如離子交換色譜-反相液相色譜結(jié)合、凝膠過(guò)濾色譜-反相高效液相色譜結(jié)合。XING等[38]采用陰離子交換柱和反相高效液相色譜聯(lián)用對(duì)宣威火腿的多肽組分進(jìn)行了分離，根據(jù)其電荷性和疏水性的不同，分離出了抗氧化活性較強(qiáng)的組分。除了2種分離方法聯(lián)用外，3種分離方法的聯(lián)用也被普遍應(yīng)用，多種分離技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，更有利于復(fù)雜樣品的分離純化。

3.2 生物活性肽一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

生物活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定方法研究對(duì)于揭示多肽結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系具有重要意義。目前發(fā)酵動(dòng)物性食品中生物活性肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析方法主要有電泳法和質(zhì)譜法。

不同發(fā)酵動(dòng)物性食品源的ACE抑制肽氨基酸序列和肽鏈長(zhǎng)度各不相同，但都具有相似的生理功能，生物活性肽肽鏈C-端氨基酸的組成是與ACE活性部位結(jié)合的關(guān)鍵，因此C-端的三肽序列會(huì)影響ACE抑制活性。有研究表明[39]，該三肽序列為疏水性氨基酸(芳香族氨基酸/帶支鏈氨基酸)或?yàn)橘嚢彼岷途彼崆姚?氨基帶正電荷均可提高ACE抑制活力。總之，活性較強(qiáng)的ACE抑制肽肽鏈N-端一般為疏水性氨基酸或堿性氨基酸，C-端一般為具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸或脯氨酸。

在抗氧化肽中，氨基酸的組成及其在肽段中的位置是其抗氧化活性強(qiáng)度的主要影響因素，目前，已有研究表明抗氧化肽肽段中含有His、Leu、Met及芳香族氨基酸(Tyr、Trp、Phe)可提高其自由基清除能力。發(fā)酵乳制品來(lái)源的抗氧化肽中Tyr、His、Lys、Pro等氨基酸含量高，Cys含量低。金華火腿和宣威火腿的抗氧化肽中His含量最高，其次為Glu、Lys、Asp、Val和Leu，而Cys的含量均最低[27]。這些氨基酸都具有自由基清除能力，但這些氨基酸的組成含量以及在肽段中的位置對(duì)發(fā)酵動(dòng)物性食品來(lái)源的抗氧化肽活性的影響有待進(jìn)一步探討。

邢路娟[27]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)成功對(duì)宣威火腿中抗氧化肽進(jìn)行分離純化和二級(jí)質(zhì)譜鑒定。目前除了采用質(zhì)譜法鑒定多肽序列以外，電泳法也是一個(gè)輔助手段。電泳法不僅可快速得出多肽基本的信息(分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等)，為進(jìn)一步鑒定多肽結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可分離多肽。電泳技術(shù)包括毛細(xì)管電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳以及等電聚焦電泳等。目前，有關(guān)電泳法對(duì)發(fā)酵動(dòng)物食品中生物活性肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的研究較少，毛細(xì)管電泳技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是其對(duì)疏水性相近的肽段的分離效果較好，可為進(jìn)一步研究發(fā)酵動(dòng)物食品中生物活性肽的結(jié)構(gòu)和功能提供新的途徑。

3.3 生物活性肽的空間結(jié)構(gòu)與特殊官能團(tuán)分析

目前生物活性肽的空間結(jié)構(gòu)和特殊官能團(tuán)的分析方法主要有分子對(duì)接模擬、紅外光譜和圓二色譜等。分子對(duì)接模擬可以分析ACE抑制肽和DPP-IV抑制肽的作用位點(diǎn)和作用力。氫鍵、疏水作用、離子鍵和范德華力等是維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重要因素，抑制肽對(duì)酶的抑制作用是通過(guò)氫鍵和疏水作用等作用力實(shí)現(xiàn)的。采用Gold進(jìn)行分子對(duì)接模擬，可以預(yù)測(cè)ACE抑制肽或DPP-IV抑制肽能否與相關(guān)酶的主要活性部位氨基酸結(jié)合形成氫鍵，從而抑制ACE或DPP-IV與其他底物相結(jié)合，進(jìn)而起到降低相關(guān)酶活性的作用。通過(guò)分子對(duì)接模擬分析可以得到肽段與酶結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)圖和二維結(jié)構(gòu)圖，說(shuō)明肽段可與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合形成氫鍵，并且得出氫鍵和范德華力的共同存在可使酶與多肽的結(jié)合更穩(wěn)定[6]。因此，DPP-IV和ACE抑制肽的抑制活性與肽和酶結(jié)合的穩(wěn)定性相關(guān)。

紅外光譜(infrared spectrum,IR)可通過(guò)特征基團(tuán)的伸縮振動(dòng)來(lái)推測(cè)多肽中可能存在的基團(tuán)，也可通過(guò)對(duì)比紅外光譜譜圖峰形變化來(lái)確定化學(xué)反應(yīng)前后多肽發(fā)生變化的基團(tuán)。該方法主要用來(lái)分析多肽中存在的基團(tuán)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)。核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)通常與紅外光譜聯(lián)用，鑒定多肽中存在的特殊官能團(tuán)，一般可用來(lái)分析少于30個(gè)氨基酸組成的多肽。圓二色譜(circular dichroism,CD)可對(duì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定和分析預(yù)測(cè)，對(duì)于進(jìn)一步全面了解多肽的空間結(jié)構(gòu)具有重要作用[40]。

不同發(fā)酵動(dòng)物性食品來(lái)源的生物活性肽、肽鏈長(zhǎng)度不同、氨基酸組成不同，所形成的空間結(jié)構(gòu)也會(huì)不同，但目前有關(guān)發(fā)酵動(dòng)物食品中生物活性肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)鑒定的研究較少，分子對(duì)接模擬、紅外光譜和圓二色譜等分析方法可結(jié)合細(xì)胞水平和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究生物活性肽結(jié)構(gòu)和功能間的關(guān)系。

4 生物活性肽生物信息學(xué)研究方法

生物活性肽構(gòu)效關(guān)系的研究已經(jīng)取得一些進(jìn)展，生物活性肽的氨基酸序列可以通過(guò)多種方法鑒定出來(lái)，但生物活性肽的功能活性和分子機(jī)制的研究方法目前還是需要大批量、高強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)操作。為了提高科研效率，一些生物信息學(xué)網(wǎng)址提供的軟件和功能團(tuán)模型可基于影響肽功能活性的結(jié)構(gòu)特征和理化因素對(duì)肽段進(jìn)行高效的虛擬篩選，并且可以利用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等新型生物信息學(xué)技術(shù)以進(jìn)一步系統(tǒng)的研究生物活性肽發(fā)揮功能活性的作用機(jī)制。表2為分析生物活性肽肽段序列常用的生物信息學(xué)研究工具。

UniProt是目前使用最廣泛的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，UniProt主要功能分為以下兩個(gè)部分：來(lái)源于實(shí)驗(yàn)的有詳細(xì)注釋的序列(SwissProt)和自動(dòng)注釋序列(TrEMBL)。有詳細(xì)注釋的序列源于Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)，可信度非常高。源于TrEMBL的自動(dòng)注釋序列是由核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為蛋白質(zhì)編碼區(qū)的自動(dòng)翻譯而成的序列，可信度較低，但也有一定的參考價(jià)值。UniProt整合了多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)資源，與100多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)一了編號(hào)，可相互參照，互相鏈接，在UniProt中可用關(guān)鍵詞和序列比對(duì)對(duì)多肽序列進(jìn)行檢索。UniProt中的UniRef板塊在UniProtKB板塊的基礎(chǔ)上可獲得冗余度更低的蛋白質(zhì)序列。UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的Proteomes板塊收錄了已知物種編碼的所有蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)組學(xué)信息。

一般情況下，從天然來(lái)源的食物中分離純化并鑒定功能活性肽的結(jié)構(gòu)，以及驗(yàn)證肽的活性，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。而在線數(shù)據(jù)庫(kù)和計(jì)算機(jī)分析工具等生物信息技術(shù)具有高效、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，因此可以廣泛應(yīng)用于功能肽的預(yù)測(cè)和鑒定中。另外，在綜合分析肽理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)生物信息學(xué)工具可進(jìn)一步探究肽氨基酸殘基對(duì)其功能活性的影響，進(jìn)而在很大程度上減少實(shí)驗(yàn)量，高效獲得具有高活性的生物活性肽。

表2 分析肽段序列常用的生物信息學(xué)研究工具[41-43]Table 2 Bioinformatics tools for analyzing peptide sequences

5 發(fā)酵動(dòng)物性食品來(lái)源生物活性肽的形成機(jī)理

研究表明，許多傳統(tǒng)的發(fā)酵動(dòng)物性食品的加工時(shí)間較長(zhǎng)，蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶及微生物共同作用下，降解為結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單的二肽、三肽、寡肽或其他小分子多肽。下面以干腌火腿為例具體闡述發(fā)酵動(dòng)物性食品在加工過(guò)程中生物活性肽形成機(jī)理。

豬肉肌肉含有多種蛋白水解酶，尤其是內(nèi)肽酶和外肽酶，它們?cè)诟呻邕^(guò)程中對(duì)肌原纖維和肌漿蛋白的水解起著重要作用。蛋白質(zhì)水解是先由內(nèi)肽酶啟動(dòng)的，例如鈣蛋白酶和組織蛋白酶，特別是在后續(xù)15個(gè)月的加工過(guò)程中仍然活躍的組織蛋白酶B、H和L，可使蛋白質(zhì)被水解成小分子的蛋白和多肽。這些多肽可以被外肽酶進(jìn)一步水解，產(chǎn)生小肽和游離氨基酸[44]。蛋白質(zhì)水解的程度和產(chǎn)生的生物活性肽數(shù)量受多個(gè)因素影響，包括原材料、肌肉酶的類型和活性、加工條件和加工時(shí)間等。如隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)，肉的水分活度會(huì)降低，肌肉肽酶活性會(huì)在一定程度上有所下降，但在整個(gè)加工過(guò)程中肌肉的內(nèi)源酶還是會(huì)保持一定的活性的[45]。

研究表明，西班牙傳統(tǒng)干腌火腿成熟期間，肌肉在肽酶的作用下產(chǎn)生大量游離氨基酸和多肽。肌肉蛋白首先被內(nèi)源性內(nèi)肽酶(肽鏈內(nèi)切酶)水解，然后被一系列外肽酶進(jìn)行連續(xù)的水解。這些蛋白質(zhì)水解反應(yīng)是非常劇烈的，可以產(chǎn)生大量的游離氨基酸和不同序列與長(zhǎng)度的肽類物質(zhì)，其中一些具有一定的生理活性，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性、抗氧化活性、二肽基肽酶IV抑制活性、體內(nèi)抗高血壓活性、降血糖活性和抗炎活性等[46]。目前應(yīng)用肽組學(xué)工具可模擬火腿腌制等復(fù)雜化學(xué)變化以及模擬后續(xù)蛋白質(zhì)水解過(guò)程，并且使鑒定感興趣的肽段序列成為可能。研究表明，很多生物活性肽作為肌肉蛋白的一部分時(shí)沒(méi)有活性，但在干腌加工或胃腸消化過(guò)程中會(huì)被肌肉肽酶水解釋放出來(lái)，從而變得有生物活性[47]。

研究表明，主要的肌肉肽酶包括三肽酶(tripeptidase,TPP)和二肽酶(dipeptidase,DPP)，它們可以水解小分子蛋白和多肽N端的三肽和二肽。其中DPP Ⅰ、DPP Ⅱ和TPP Ⅰ的活性特別高，因?yàn)樗鼈冊(cè)谖⑺嵝?pH 5.5～6.5)的條件下活性最強(qiáng)，該微酸性條件與加工過(guò)程中火腿的pH(6.0～6.5)相接近。在西班牙干腌火腿加工過(guò)程中，被外肽酶水解的二肽有TS、TL、FD、VK、AT和QT，三肽有SRG、TVQ、NAS、KIE和GKM[7]。DPP Ⅰ和DPP Ⅱ可以從N端水解成如AE、RG、NP、IL、AG、SG和SQ等的二肽，而TPP I可以從N端水解成如IIP、RGA、GNP、GAG和GPG等的三肽，在N端主要由丙氨酰基和甲硫氨酰基氨基肽酶水解，釋放的氨基酸有Gly、Ser、Ala、Leu和Ile，而C端由羧基肽酶A和B水解，釋放的氨基酸有Leu、Tyr、Lys、Ala、Gly、Glu和Asp[48]。金華火腿在最后的加工階段持續(xù)的高溫有助于蛋白質(zhì)的水解，進(jìn)而產(chǎn)生大量的肽類物質(zhì)，尤其是二肽(占23.59%)和三肽(占48.28%)。二肽主要包括VE、PL、AH和AR等，三肽主要包括LPK、SGL、AAP、SGV和LHA等，其他參與蛋白質(zhì)水解的外肽酶包括氨基肽酶和羧肽酶，它們分別從N端和C端開始水解蛋白質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生大量的游離氨基酸和小分子肽[49]。

然而，迄今為止，干腌火腿成熟過(guò)程中自然產(chǎn)生的多肽的結(jié)構(gòu)特征仍不清楚，特別是它們的生物活性與涉及加工過(guò)程的代謝反應(yīng)的相關(guān)性尚不明確。另外，需要進(jìn)一步研究影響干腌火腿生產(chǎn)加工過(guò)程中生物活性肽釋放的潛在因素。

6 總結(jié)和展望

目前，有關(guān)發(fā)酵動(dòng)物性食品生物活性肽的分離、純化和鑒定的研究手段已較為完善，但該領(lǐng)域還有許多問(wèn)題有待深入研究：(1)有待挖掘和研究促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程中生物活性肽高產(chǎn)出的菌株；(2)不同種類生物活性肽在體內(nèi)的生物利用率和作用機(jī)理研究較少；(3)多個(gè)具有不同空間結(jié)構(gòu)和不同氨基酸序列的生物活性肽在同時(shí)發(fā)揮其各種生理功能時(shí)是否有協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究;(4)缺乏細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、人體臨床實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步驗(yàn)證多種生物活性肽的生理功能。