氟西汀對單眼剝奪弱視大鼠視皮質神經細胞突觸可塑性的影響及相關機制

羅賢令 吳羅玲

杭州市富陽區第一人民醫院眼科，浙江杭州 311400

弱視影響兒童視功能健康發育，對雙眼視功能及立體視覺具有影響[1-2]。研究顯示，視皮層形態結構改變導致視皮層可塑性降低是弱視發生的關鍵原因[3-4]。治療多采用常規遮蓋療法、精細目力訓練等治療，但存在時限性等問題，且對于超過視覺發育敏感期的患者，治療效果甚微[5-7]。氟西汀是抗抑郁藥物，其可增加成年弱視大鼠視皮層神經元可塑性，但具體機制尚未闡明[8]。研究顯示，促進ERK/CREB 通路活化可激活腦缺血再灌注大鼠神經元突觸可塑性，改善小鼠神經功能[9]。氟西汀能夠激活CREB 通路，改善慢性應激大鼠神經功能[10]。目前，有關氟西汀對弱視視皮層神經元可塑性的影響是否與調控ERK/CREB 通路有關少見報道，本研究對此進行探究。

1 對象與方法

1.1 試驗動物

60 只14 日齡SPF 級SD 雄性大鼠，體重（55±10）g，購于北京唯尚立德生物科技有限公司，使用許可證號SYXK（京）2021-0056，生產許可證號SCXK（京）2016-0009。本研究經杭州市富陽區第一人民醫院醫學倫理委員會審批通過（CX-006-03）。

1.2 主要試劑與儀器

氟西汀（生產批號：114247-09-5，海思生物技術有限公司）；醋酸雙氧鈾（生產批號：CAS6159-44-0，青島捷世康生物科技有限公司）；復方托吡卡胺滴眼液（生產批號：14200529809，華潤雙鶴藥業股份有限公司）；左旋多巴（生產批號：CCPE900086，廣州佳途科技股份有限公司）；兔抗鼠ERK1/2（生產批號：33047M）、p-ERK1/2（生產批號：33016M）、CREB（生產批號：33052M）、p-CREB（生產批號：33008M）及β-actin（生產批號：33036M）多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗（生產批號：33141M）均購于上海雅吉生物科技有限公司。

IX-RA-834 型小動物多功能圖形翻轉視覺誘發電位儀（上海玉研科學儀器有限公司）；BD-4R 型透射式電子顯微鏡（深圳市博視達光學儀器有限公司）。

1.3 動物分組及建模

60 只大鼠選取10 只為對照組，余50 只建立單眼弱視模型并檢驗建模是否成功。具體操作見文獻[11]。建模成功的50 只大鼠按照隨機數字法分為陽性藥組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10 只。

1.4 藥物處理

低、中、高劑量組大鼠于之后每日早8:00 腹腔注射氟西汀5、10、20 mg/（kg·d）[12]，模型組、對照組腹腔注射等量生理鹽水，陽性藥組大鼠灌胃左旋多巴80 mg/（kg·d），給藥28 d。

1.5 圖形視覺誘發電位（pattern visual evoked potential，PVEP）檢測各組大鼠P100 潛伏期、P100 幅值

各組大鼠末次給藥結束后進行PVEP 檢測：剪開大鼠縫合的眼瞼緣，暗室內適應30 min，1%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，一次性給予復方托吡卡胺滴眼液充分擴瞳，然后采用多功能圖形翻轉視覺誘發電位儀（閃爍光為刺激光，頻率為1.0 Hz，通頻帶寬0.5～85.0 Hz，分析時間250 ms，疊加60 次）進行PVEP 檢測，連續測3 次取平均值，比較分析各組大鼠P100潛伏期、P100幅值，具體操作見文獻[13]。

1.6 透射電子顯微鏡觀察視皮層神經元細胞突觸超微結構

PVEP 檢測結束后，立即處死大鼠，取大腦左側視皮層組織，分為兩部分。其中一部分經2.5%戊二醛、磷酸鹽緩沖液固定2 h，1%鋨酸固定液固定3 h，梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續切片（50 nm厚），3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，于透射電子顯微鏡下觀察皮層突觸超微結構，并利用IPP 6.0 圖像分析軟件（美國MedrnCybernetics 公司）分析并記錄各組大鼠視皮層神經元突觸間隙及突觸后致密物厚度。

1.7 免疫印跡法檢測視皮層組織中ERK/CREB 通路蛋白水平

將另一部分視皮層組織制備組織勻漿，提取總蛋白并檢測濃度及純度，電泳、轉膜、脫脂奶粉（5%）室溫封閉2 h，分別加入一抗ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB及內參β-actin（1∶1 000）的稀釋比，次日加入HRP 標記山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，顯色、顯影、定影，根據各蛋白條帶灰度值計算各目標基因蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠P100 潛伏期、P100 幅值比較

模型組大鼠P100潛伏期高于對照組，P100幅值低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。低、中、高劑量組大鼠P100潛伏期低于模型組，P100幅值高于模型組；中、高劑量組大鼠P100潛伏期低于低劑量組，P100幅值高于低劑量組；高劑量組大鼠P100潛伏期低于中劑量組，P100幅值高于中劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠P100 潛伏期、P100 幅值比較（）

表1 各組大鼠P100 潛伏期、P100 幅值比較（）

注與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與低劑量組比較，cP ＜0.05；與中劑量組比較，dP ＜0.05

2.2 各組大鼠視皮層神經細胞突觸超微結構變化

對照組大鼠視皮層神經元結構正常；模型組大鼠突觸結構模糊，突觸間隙消失，突觸小泡隱約可見，髓鞘板層結構松解，細胞電子密度降低，突觸結構出現病理損傷；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠視皮層神經元突觸結構稍清晰，可見突觸間隙及突觸小泡，髓鞘板層結構清晰。見圖1。

圖1 各組大鼠視皮層神經細胞突觸超微結構變化（400×）

2.3 各組大鼠視皮層突觸間隙及突觸致密厚度比較

模型組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。低、中、高劑量組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度低于模型組；中、高劑量組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度低于低劑量組；高劑量組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度低于中劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠視皮層突觸間隙及突觸致密厚度比較（）

表2 各組大鼠視皮層突觸間隙及突觸致密厚度比較（）

注與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與低劑量組比較，cP ＜0.05；與中劑量組比較，dP ＜0.05

2.4 各組大鼠視皮層ERK/CREB 通路蛋白比較

模型組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。低、中、高劑量組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 高于模型組；中、高劑量組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 高于低劑量組；高劑量組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 高于中劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠視皮層組織中ERK/CREB 通路蛋白

表3 各組大鼠視皮層ERK/CREB 通路蛋白水平比較（）

表3 各組大鼠視皮層ERK/CREB 通路蛋白水平比較（）

注與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與低劑量組比較，cP ＜0.05；與中劑量組比較，dP ＜0.05

3 討論

弱視與視覺發育相關，多發于兒童[14]。由視覺發育關鍵期內不良的視環境及單眼斜視、形覺剝奪等多種因素引起的單眼或雙眼最佳矯正視力下降[15-16]。常規治療方法存在時限性，且治療效果不佳[17-18]。氟西汀是抗抑郁藥，其對單眼形覺剝奪大鼠視覺可塑性有調控作用，但機制尚未明確[19-20]。視覺系統能夠根據外界視覺環境的刺激調整和改變突觸結構，此過程為視覺發育可塑性。研究表明，視皮層神經元突觸發育可塑性在弱視發生發展過程中發揮關鍵作用[21]。

PVEP 的主要波形P100波及其波幅能反映視神經軸索及視神經傳導功能[22]。本研究結果顯示，模型組大鼠P100潛伏期高于對照組，P100幅值低于對照組；低、中、高劑量組大鼠P100潛伏期低于模型組，P100幅值高于模型組。提示氟西汀可能拮抗視覺剝奪對視覺系統的損害，促進視神經鞘膜與軸索功能恢復。突觸是神經元之間傳遞信息的重要結構，其結構異常改變能使神經系統結構及功能發生改變。本研究結果顯示，模型組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度高于對照組；低、中、高劑量組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度低于模型組。提示氟西汀可能對神經元細胞突觸結構有保護作用，可改善突觸功能進而恢復視功能。

研究顯示，ERK 通過調控CREB 參與海馬神經細胞新樹突棘的生成，CREB 是細胞內效應因子，參與神經元生長、突觸可塑性等，其轉錄活性依賴于第133 位絲氨酸殘基的磷酸化反應，p-CREB 可通過調節下游基因轉錄活性參與神經元的生長[23-24]。金霏等[25]研究顯示，促進CREB 通路活化可對小鼠海馬神經元突觸功能發揮保護作用。本研究結果顯示，模型組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 水平低于對照組；低、中、高劑量組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 水平高于模型組。提示氟西汀可能通過促進ERK/CREB 通路活化對單眼剝奪弱視大鼠視皮層神經細胞突觸可塑性的恢復發揮促進作用。

綜上，氟西汀能夠恢復單眼剝奪弱視大鼠視皮層神經細胞突觸超微結構，激活視皮層結構可塑性，可能是通過激活ERK/CREB 通路實現的。