簡析非洲豬瘟病毒快速檢測方法研究進展

董紅艷

（河北省廊坊市農業農村局 065000）

非洲豬瘟(African Swine fever,East African Swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起，ASFV 是一類復雜的DNA病毒，直徑較大，能達到175～210nm。成熟體有兩層以上衣殼，外部包裹囊膜。該病毒是現在已知唯一的昆蟲媒介DNA病毒。經細胞迭代或血清阻斷后可喪失吸附特性。

1 非洲豬瘟的性質及危害

非洲豬瘟（ASF）最早在非洲肯尼亞被發現，目前在非洲、歐洲、美洲的幾十個國家流行，在我國東部、東北部和西南部也有非洲豬瘟疫情傳播。該病在臨床上存在全身出血、發熱、神經系統障礙等癥狀，并有以下幾個特點，發病時間短、傳染速度快、致死率高等。所有品種、年齡的野豬或家豬一旦接觸都可能感染ASFV 病毒，該病對養殖業影響極大，給農民與養殖戶的經濟效益以沉重打擊，還拉動了豬肉價格急劇上漲，抬高了物價，給國家正常的農業生產帶來不小損失。

目前，還沒有研制出針對ASFV 的特效藥，由于ASFV 病毒基因組十分復雜，其不同毒株的基因組長度可能在171～191kb 之間，編碼151～166 個閱讀框，基本可分為24 個基因型。變異可能性較高，具有逃逸免疫機制，對病毒作用于宿主的過程也不清楚，所以其疫苗研發進度極為緩慢。現今的防控基本以加強隔離、減少接觸、屠宰帶病牲畜、對養殖地帶進行全方位消殺等手段為主。所以，對于ASFV 病毒的早期識別與檢測顯得極為重要。

2 非洲豬瘟病毒的快速檢測方法

2.1 從病原著手實現的檢測方法

2.1.1 病毒分離培養檢測技術

病毒分離培養檢測技術是最傳統的檢測方法之一，有“金標準”的美譽。操作方法：一般先將疑似的ASFV 樣本接種于單核細胞或合適的原代細胞中，培養期間，根據病毒增殖情況可適量添加生長因子、血清等，最終獲得分離出來的毒株。對其進行鑒定，一般出現紅細胞吸附現象48～72h 后，細胞出現病變情況即可說明疑似樣本中含有ASFV。

2.1.2 熒光抗體檢測技術

熒光抗體檢測（FAT）也是常用的一種檢測方式，其特點是較為經濟，檢測時間較短。原理是使用熒光色素結合抗體檢測，將疑似感染的ASFV 樣本固定于顯微鏡下，加入血清，血清中被熒光素標記的抗體即可與樣本中的抗原相結合，但由于該方式必須使用顯微鏡，不能用于現場檢驗[1]。

2.1.3 紅細胞吸附檢測技術

ASFV 病毒在對細胞進行感染期間會發生吸附紅細胞（HAD）的現象，因此，細胞病變之前能觀察到紅細胞形成的特殊圖像。紅細胞吸附檢測是世界衛生組織推薦的ASFV 檢測方法之一，時間較短，只需要4～10h，但ASFV 病毒中也存在沒有HAD 現象的毒株，因此，這種檢測技術逐漸被PCR 檢測技術所代替。

2.2 核酸檢測技術

ASFV 病毒的核酸檢測技術分為多種，如PCR 檢測技術、熒光定量PCR 技術、微滴數字PCR 技術、LAMP 技術等。

2.2.1 PCR 檢測技術

在實驗室環境下，PCR 是檢測ASFV 病毒應用最廣泛的技術之一，該方法簡單高效、經濟性好，能用于現場檢測，該技術根據較為復雜的基因型來設計，因此，能檢測出各類基因型的ASFV 病毒，而且這種檢測技術不僅能檢出宿主樣品中的ASFV 病毒，甚至能對攜帶病毒的昆蟲進行檢驗，敏感性較高。

當PCR 反應結束后，實驗人員需要對反應產物進行觀察，看是否存在特異性條帶物，這一過程需要開啟器皿，容易污染成品，造成假陽性的情況。而在臨床試驗中，樣品也有多種成分可能抑制PCR 反應，造成假陰性的結果。因此，在進行PCR 反應前，試驗人員需要對疑似感染樣品，包括其中的血紅素、代謝物、酸性多糖與糖蛋白組分進行預處理。

2.2.2 熒光定量PCR 檢測技術

熒光定量PCR 檢測技術（qPCR）操作步驟較為簡單，試驗流程較為方便，檢測結果較為準確，該方法即在普通PCR檢測技術的基礎上進行添加熒光色素或熒光探針，利用熒光來實時監測整個PCR 反應過程，并進行記錄。通過這種方法，可以對普通PCR 反應中的樣品進行定量分析，使其更加敏感、高效，并且該方法只對ASFV 病毒生效，其他病毒如豬口蹄疫病毒、禽流感病毒等都為陰性。整個檢測過程可縮短至1h 以內，檢測結果較為準確，極大提高了檢測人員的工作效率，為識別ASFV 病毒提供了切實有效的措施。

2.2.3 微滴數字PCR 檢測技術

微滴數字PCR 檢測技術（ddPCR）是一種新興技術，對樣品的核酸分子進行定量檢測，與熒光定量PCR 檢測技術相比，該技術不需要繪制標準曲線，檢測結果更加準確，目前，該技術被廣泛應用于各類動物病毒的檢測實驗中，鄔旭龍等針對K205r 基因組建立的微滴數字PCR 技術，其最低可以達到0.36 拷貝，也不會與其他動物病毒或樣品成分發生反應，敏感度較高，檢測效率較好。但該方法需要昂貴的檢測儀器設備，并有較為嚴格的專業技術要求，只適合于潛伏期的病毒檢測和小規模測試。

2.2.4 LAMP 技術

LAMP 技術是在體外恒溫的條件下完成的檢測方法，用肉眼即可判斷檢測結果，避免使用實驗儀器，加快了檢測速度，降低了檢測成本，對其他牲畜病毒也不會發生交叉反應，比較適用于基層現場檢測[2]。

2.3 從抗體著手實現的檢測方法

2.3.1 ELISA 檢測技術

酶聯免疫檢測技術（ELISA）是世界衛生組織指定使用的抗體檢測方法，其特點是方便、快速，并可脫離人工，使用電子設備就能實現大批量檢測。在西方，ELISA 技術的使用歷史較長，從20 世紀70 年代末就已經開始了。在國內目前的實驗室環境多采用間接ELISA 技術進行檢測。鄔旭龍等利用PK205R 作為包被抗原，建立了一種較為快速的間接ELISA 技術，該技術特異性較高，敏感性也較好，變異系數一般小于10%，優化了反應條件，提高了檢測效率。

2.3.2 膠體金免疫試紙檢測技術

膠體金免疫試紙檢測技術利用膠體金顆粒作為免疫標記，結果可利用肉眼進行分辨，不需要儀器設備，具有快捷方便、效率較高的特點。國內目前的免疫試紙制備已達到較為先進的水平，敏感性高，與其他病毒無交叉反應，在基層或現場的檢測環境中擁有較好的前景。林彥星等制備的免疫層析試紙條與進口ELISA 檢測技術的臨床對比率已達到100%。

2.4 其他病毒檢測方法

如免疫印跡檢測法，其原理與熒光抗體檢測技術類似，敏感度較高，適應性較強，與其他病毒不發生反應。但需求較為苛刻的實驗條件與較為先進的儀器設備，不利于基層快速檢測。

Abad 設計了一種晶體式生物傳感器進行ASFV 病毒的抗體檢測，可在半小時內出結果。Luminex 懸浮芯片技術以不同比例的熒光材料標記出不同抗體分子，與感染樣品結合后由流式細胞儀進行檢測。其敏感度與效率高于ELISA 檢測法[3]。

2.5 各類檢測方法的優缺點對比

目前，實驗室環境中應用最為廣泛的還是PCR 檢測技術與熒光定量PCR 檢測技術，病毒分離培養檢測雖然檢測結果較為準確，特異性較高，但時間過長，不利于疫情的快速控制。有部分ASFV 毒株不存在吸附紅細胞的現象，因此，應與PCR 結合使用。膠體金免疫試紙檢測法雖然速度快，適用于基層快速檢測，但試紙容易污染，最終結果還應結合PCR 檢測技術進行判斷。LAMP 技術由于需要打開器皿進行觀察，更易造成產物污染，發生假陰性或假陽性現象。

3 結論

非洲豬瘟已在世界范圍內大規模傳播，有效藥與疫苗的研制也遙遙無期，我們要做好打一場防控持久戰的準備。一方面，應積極進行ASFV 病毒檢測方法的不斷探索，提高檢測效率，降低檢測誤差。另一方面，應努力推進疫苗與藥物的研發，爭取早日攻克這一影響畜牧業發展的頑固病毒。