食品檢測用致瀉大腸埃希氏菌標準菌株的研究

大腸埃希氏菌是生活在腸道中的微生物，是腸道菌群的一部分。然而，某些大腸埃希氏菌類型可導致疾病的發生。致瀉大腸埃希氏菌就是一類重要的食源性病原體，是腸道疾病相關的食源性疾病的主要原因，可在人類中傳播和引起感染[1]。致瀉大腸埃希氏菌（DiarrheagenicEscherichia coli，DEC）感染可導致腹痛、腹瀉、出血性結腸炎等一系列疾病，是一個重要的公共衛生問題[2]。在我國，新版《食品安全國家標準 預包裝食品中的致病菌限量》（GB 29921—2021）中增加了致瀉大腸埃希氏菌的致病菌指標，并對肉制品和即食果蔬制品規定了限量要求。因此，其快速準確的檢測已成為重點關注的食品安全問題和衛生保健相關感染問題[3]。

DEC根據其致病性機制進行分類，涉及與宿主細胞相互作用中不同的毒力基因，值得注意的是，使用傳統的表型方法，如培養或基礎生化測試，很難將致瀉大腸埃希氏菌株與正常的糞便菌群區分開來[4]。這些年來，多重PCR、實時熒光定量PCR和等溫擴增技術等新型檢測技術在致瀉大腸埃希氏菌分子分型檢測中發揮了重要作用[5]。

標準菌株在微生物檢測中發揮著至關重要的作用，是保證檢驗數據準確可靠的有力武器[6-7]。標準菌株必須具有清晰的基因組信息背景且穩定性良好，目前劉娜等[8]已成功研制出產腸毒素大腸埃希氏菌標準物質、腸道侵襲性大腸埃希氏菌標準物質，具有我國自主知識產權。在致瀉大腸埃希氏菌的檢測方法中，要求有陰陽性對照，但對標準菌株編號未作要求。本文利用生化鑒定、PCR鑒定評價了6株試驗菌株作為檢測標準中陰陽性對照菌株的可行性，為檢測機構在選擇標準菌株時提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

5株大腸埃希氏菌采購于中國工業微生物菌種保藏管理中心，分別為腸道集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）CICC 24186、腸道出血性大腸埃希氏菌（EHEC）CICC 24187、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）CICC 24188、腸道致病性大腸埃希氏菌（EPEC）CICC 24189和產腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）CICC 24190；1株大腸埃希氏菌ATCC 25922來源于美國標準菌株保藏中心。

1.1.2 培養基及試劑

伊紅美蘭瓊脂（EMB）、革蘭氏染色試劑盒、多重PCR檢測試劑盒來源于北京陸橋技術股份有限公司；生化鑒定系統來源于法國生物梅里埃公司；6×Loading buffer、DL2000 DNA Maker均來源于寶日醫生物技術有限公司；1×TAE緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠溶液均來源于生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器設備

GR85DA高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；HPS-250生化培養箱，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；BSC-1360 Ⅱ B2生物安全柜，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；A200 PCR儀，杭州朗基科學儀器有限公司；JY300E電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；JY02G凝膠快速成像儀，北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌落及顯微形態觀察

將6株試驗菌株分別接種于MAC、EMB培養基上，置于36 ℃培養24 h后，觀察其菌落形態，并利用生物顯微鏡進行顯微形態觀察。

1.3.2 生化鑒定

將菌懸液接種于生化鑒定卡中，對20種生化反應進行檢測鑒定；接種后置于36 ℃培養24 h，再滴加反應試劑，讀取檢測結果并登錄鑒定系統獲取鑒定結果。

1.3.3 基因組DNA提取

利用PCR試劑盒提取6株試驗菌株基因組，用接種環取兩環菌落，溶于200 μL裂解液中，渦旋混勻，金屬浴99 ℃或沸水浴裂解20 min，冰浴冷卻后12 000×g離心4 min，取上清即為模板。

1.3.4 多重PCR擴增

取PCR Buffer 23 μL加入PCR管中，再加入2 μL DNA模板，總反應體系25 μL。預變性95 ℃，5 min；變性 95 ℃，30 s，復性 63 ℃，30 s，延伸 72 ℃，1.5 min，40個循環；72 ℃延伸10 min。

1.3.5 致瀉性大腸埃希氏菌毒力基因檢測

參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》（GB 4789.6—2016）的方法，將獲得的PCR擴增產物使用瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌落及顯微形態觀察

6株試驗菌株在EMB培養基上為紫黑色、光滑、濕潤、邊緣整齊的圓形菌落；在MAC培養基上菌落呈粉紅色、圓形、表面光滑；6株試驗菌株顯微形態為短桿狀、革蘭氏陰性菌。

2.2 生化鑒定結果

將生化反應結果上傳到生化鑒定系統中，鑒定結果如表1所示。6株試驗菌株鑒定結果均為大腸埃希氏菌，鑒定概率百分比分別為99.9%、99.9%、99.8%、98.5%、99.8%和99.8%，置信度滿足試驗要求，鑒定結果可靠。

表1 6株試驗菌株生化鑒定結果表

2.3 致瀉性大腸埃希氏菌毒力基因檢測結果

依據GB 4789.6—2016標準方法，對6株大腸埃希氏菌進行特征基因PCR擴增，如圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測共擴增出17條目標條帶，目標條帶長度在150～1 500 bp。如表2所示，6株試驗菌株ATCC 25922、CICC 24186、CICC 24187、CICC 24188、CICC 24189和CICC 24190檢測出不同的毒力基因條帶。菌株ATCC 25922只檢出uidA基因條帶，符合非致瀉大腸埃希氏菌特征；CICC 24186檢出uidA、pic、aggR、astA毒力基因，符合EAEC特征；CICC 24187檢出uidA、escV、stx2、stx1毒力基因，未檢出bfpB毒力基因，符合EHEC特征；CICC 24188檢出uidA、invE基因，符合EIEC特征；CICC 24189檢出uidA、bfpB、escV基因條帶，未檢出stx2、stx1條帶，符合EPEC特征；CICC 24190檢出uidA、estlb、estla毒力基因條帶，符合ETEC特征。

圖1 6株試驗菌株毒力基因凝膠電泳檢測結果圖

表2 6株大腸埃希氏菌毒力基因特征表

3 結論與討論

本文通過菌落及顯微形態觀察、生化鑒定、PCR鑒定對6株大腸埃希氏菌進行分析，并依據GB 4789.6—2016標準方法對6株大腸埃希氏菌能否作為標準菌株進行可行性分析。結果表明，6株試驗菌 株 ATCC 25922、CICC 24186、CICC 24187、CICC 24188、CICC 24189和CICC 24190均檢測出特征目標毒力基因條帶，6株試驗菌株可以作為致瀉大腸埃希氏菌檢驗的標準菌株，滿足標準要求。食品檢測用致瀉大腸埃希氏菌標準菌株的研究可為食品微生物工作提供依據，為檢測機構在選擇標準菌株時提供參考。