食品凍干粉中霉菌和酵母平板計數(shù)的不確定度評估

許多天然發(fā)酵的食品是由霉菌、酵母菌和細菌共同作用而產(chǎn)生的，但它們也是導(dǎo)致大量食品被銷毀的罪魁禍首，同時是影響食品加工和貯藏的主要因素。部分霉菌在特定條件下會產(chǎn)生真菌毒素，這些毒素對人類是有害的[1]。所以霉菌和酵母作為指示菌被用于食品的衛(wèi)生質(zhì)量評價，霉菌和酵母計數(shù)又被用于評估食品受污染情況。我國的食品安全國家標準中對糕點、面包、飲料等食品中的霉菌和酵母均有嚴格的限量要求，且限量值較低[2-3]。此外霉菌孢子易擴散，稍有偏差檢驗結(jié)果就可能超出限量值，因此檢驗過程中需要做好質(zhì)量控制，確保結(jié)果的準確可靠。

不確定度評估作為衡量檢測結(jié)果質(zhì)量的指標，可為檢測報告提供準確、可靠的科學(xué)依據(jù)。在《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS-CL01-A001：2018）[4]中要求在微生物檢測過程中，考慮測量不確定度對于檢測結(jié)果的重要性，列出各主要的不確定度分量，并作出合理的評估。本實驗依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）[5]中平板計數(shù)法的要求對食品凍干粉中霉菌和酵母進行檢驗，并參照《測量不確定度的要求》（CNAS-CL01-G003：2018）[6]、《食品微生物學(xué)測量不確定度評估指南》（SN/T 4091—2015）[7]和《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》（RB /T 151—2016）[8]中的相關(guān)標準和規(guī)范要求，評估了檢驗結(jié)果的不確定度，并分析與評定了各不確定度分量的影響。為實驗室進行食品中霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果的準確測定提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霉菌和酵母食品凍干粉（特性值：290 CFU·mL-1），中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉，廣東廣試試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GB85DR高壓滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；生物安全柜，賽默飛世爾（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

食品凍干粉的使用：無菌開啟西林瓶，樣品開啟后，隨即添加5 mL無菌生理鹽水重新水化凍干粉，待凍干粉溶解后，將溶液轉(zhuǎn)移至無菌三角瓶內(nèi)，然后用剩余的無菌生理鹽水反復(fù)沖洗西林瓶的內(nèi)壁，并將清洗液回收至上述無菌三角瓶內(nèi)，此溶液即為待測樣品原液，等同于60 mL的食品樣品。

1.3.2 檢驗檢測

依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）[5]中的第一法霉菌和酵母平板計數(shù)法進行操作。使用10 mL無菌吸管從1.3.1制備的樣品中吸取25 mL溶液至裝有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶內(nèi)，振搖均勻后制得1∶10的樣品勻液。使用2 mL的無菌吸管吸取2 mL 1∶10的樣品勻液，釋放1 mL至裝有9 mL無菌生理鹽水的試管內(nèi)，渦旋攪拌均勻后制得1∶100的樣品勻液。在進行上述10倍遞增稀釋操作過程中，分別吸取1 mL每個稀釋度的樣品勻液（包括原液）至2個無菌平皿中。同時各吸取1 mL無菌生理鹽水至2個無菌平皿中作為空白對照。在制備好的平皿中傾注20～25 mL保溫至50 ℃的孟加拉紅瓊脂，并轉(zhuǎn)動平皿混均。隨后正置在水平臺上待培養(yǎng)基冷卻至完全凝固后，正置在（28±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)到第5天時對結(jié)果進行觀察和記錄。在實驗條件相對不變的情況下對該樣品進行10次重復(fù)檢測。

1.3.3 結(jié)果計算

選取單個平皿上菌落數(shù)分布于10～150 CFU的相同稀釋度的2個平皿進行計數(shù)，計數(shù)結(jié)果計算公式為

式中：N為樣品的菌落數(shù)，CFU；∑C為計數(shù)平板的菌落數(shù)之和（CFU）；n為計數(shù)平板個數(shù)；d為稀釋因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)不確定度來源的分析，本實驗對稱樣制備、稀釋、加樣體積、培養(yǎng)基的菌落生長率以及重復(fù)測量的不確定度分量進行分析，詳見表1。

表1 霉菌和酵母計數(shù)測量不確定度的主要來源表

2.2 不確定度評估

2.2.1 樣品制備、稀釋及加樣中產(chǎn)生的不確定度

本次實驗選取稀釋因子為10-1的平板結(jié)果進行計數(shù)報告，主要涉及樣品原液的制備和225 mL稀釋液的使用，所用的量器為250 mL的量出式量筒和10 mL的流出式分度吸管，加樣過程中使用的是2 mL的流出式分度吸管，參照《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[9]中檢定規(guī)程的規(guī)定，20 ℃時，250 mL量筒（量出式）的容量允差是2.0 mL；10 mL移液管（A級）的容量差是0.05 mL；2 mL移液管（A級）的容量允許偏差是0.012 mL，取矩形分布為

因此，樣品稀釋過程中所產(chǎn)生的不確定度為

由于該實驗是在20 ℃相對恒定的條件下進行的，因此不考慮容量瓶、溶液溫度和校準時溫度不同所引起的不確定度。若溫度不是20 ℃，則需計算溫度對體積的影響。

2.2.2 培養(yǎng)基菌落生長率的不確定度

本次實驗選用孟加拉瓊脂紅培養(yǎng)基作為霉菌和酵母計數(shù)的平板計數(shù)瓊脂，該培養(yǎng)基為商品化培養(yǎng)基，根據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）[10]中目標菌半定量劃線法獲得孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基的生長指數(shù)G，并依據(jù)G的大小對培養(yǎng)基的質(zhì)量進行評價。每個培養(yǎng)皿上的G值最大是16，通過對孟加拉紅瓊脂進行目標菌半定量劃線，得到6批孟加拉紅瓊脂的G值平均數(shù)為14.95，即菌落生長率R為

菌落生長率誤差范圍為1-0.9344=0.0656，假定菌落生長率服從矩形分布，則其不確定度為

2.2.3 重復(fù)性檢驗的不確定度

在相同條件下，對同一份凍干粉樣液進行10次檢測，由于10次檢測結(jié)果發(fā)散性較大，故對檢驗結(jié)果取對數(shù)后進行不確定度計算，檢測結(jié)果見表2。由10次檢驗結(jié)果求得的平均值為223 CFU·mL-1，依據(jù)GB 4789.15—2016檢驗結(jié)果計數(shù)規(guī)則，結(jié)果采用兩位有效數(shù)字，故平均值取220 CFU·mL-1進行計算。

表2 樣品測量結(jié)果表

霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果的對數(shù)算術(shù)平均值為

單次檢驗結(jié)果的不確定度為

重復(fù)性檢驗結(jié)果的不確定度為

2.2.4 檢測結(jié)果的合成不確定度

檢測結(jié)果的合成不確定主要由樣品稀釋過程中所產(chǎn)生的不確定度、菌落生長率的不確定度和重復(fù)性檢驗結(jié)果的不確定度進行擬合，結(jié)果為

2.2.5 檢測結(jié)果的擴展不確定度

選取置信概率p為95%，則自由度v=10-1=9，由t分布表可得檢測結(jié)果的擴展不確定度包含因子k=1.833 1，則擴展不確定度為Urel=k×urel=1.833 1×4.36%=7.99%。

霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果的對數(shù)算術(shù)平均值=2.342 4，因此，U=Urel×=7.99%×2.342 4=0.187

當(dāng)檢驗結(jié)果表示為對數(shù)的平均值時，其取值區(qū)間為±0.187，即2.342±0.187。當(dāng)檢驗結(jié)果表示為平均值時，檢驗結(jié)果的取值區(qū)間分布可通過對數(shù)值的取值再取反對數(shù)得到，即10(2.342±0.187)CFU·mL-1，故本次實驗中測定的霉菌和酵母數(shù)量分布于140～340 CFU·mL-1。

3 結(jié)論與討論

本次實驗主要對樣品、菌落生長率和重復(fù)性檢驗結(jié)果的不確定度進行評估，從相對標準不確定度計算的結(jié)果對比，培養(yǎng)基菌落生長率引入的不確定度（3.79%）最大，重復(fù)性檢驗（2.04%）次之，樣品的制備稀釋（0.682%）最小。郭麗艷[11]等通過對能力驗證樣品中霉菌和酵母的檢驗結(jié)果不確定評估顯示，不確定度影響最大的是加樣體積；胡婕[12]等通過對面包中霉菌的檢驗結(jié)果不確定度評估顯示，不確定度影響最大的是檢測過程中的重復(fù)性檢測，但二者均未對培養(yǎng)基中菌落生長率的不確定度進行評估；趙麗[13]等通過對糕點中菌落總數(shù)檢驗結(jié)果的不確定度評估顯示，不確定度影響最大的是重復(fù)性檢驗和培養(yǎng)基的菌落生長率，其分析和評估結(jié)果與本實驗基本一致。因此，對于微生物檢測過程中培養(yǎng)基的配制時間、滅菌溫度、質(zhì)量控制等應(yīng)加強實驗室管理，制定相關(guān)的作業(yè)指導(dǎo)書，保證檢測過程中培養(yǎng)基的質(zhì)量；在樣品檢驗中，應(yīng)通過加強質(zhì)量控制，對檢測人員應(yīng)通過人員比對、質(zhì)控樣品等質(zhì)量控制方式進行質(zhì)量監(jiān)督，對天平和常用玻璃器皿等設(shè)施設(shè)備應(yīng)定期進行計量校準，平時使用過程中還可通過期間核查的方式進行檢查，并嚴格按照儀器設(shè)備的操作規(guī)程進行使用，確保儀器設(shè)備的準確性，最大程度減少這些分量引入的不確定度。