miR-497對THP-1巨噬細胞NLRP1表達及膽固醇流出的影響

羅清宇 曾高峰 黃斌 陳孔 秦英楠

(南華大學附屬第二醫院 1功能檢查科，湖南 衡陽 421000；2心血管內科)

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性心血管疾病，是工業化社會和世界范圍內死亡的主要原因〔1〕。巨噬細胞對低密度脂蛋白(LDL)的修飾是導致泡沫細胞形成的主要過程，并有助于炎癥環境和AS斑塊進展〔2〕。巨噬細胞源性泡沫細胞中脂質沉積的減輕是一種很有前途的AS治療策略〔3〕。研究表明，NOD樣受體家族，含有Pyrin結構域NLR家族蛋白(NLRP)1炎性體在AS發展中起重要作用〔4〕。據報道，活化的NLRP1炎性體促進巨噬細胞源性泡沫細胞的形成〔5〕。因此，尋找調控NLRP1表達和抑制炎癥反應的潛在機制對于AS的防治具有重要意義。隨著分子生物學的發展，分子生物標志物的研究為各種疾病治療提供了有效的治療靶點。據報道，miRNA是一類小RNA，參與AS的進展，并被認為是AS的潛在生物標志物和有吸引力的治療方法〔6〕。在眾多miRNA中，miR-497廣泛參與細胞分裂、代謝及應激反應；之前研究證實在人腎小球系膜細胞中miR-497可抑制NLRP1蛋白的表達，降低促炎細胞因子釋放〔7,8〕。然而，作為研究AS的經典細胞模型，人單核細胞白血病(THP)-1巨噬細胞中miR-497是否可靶向抑制NLRP1表達，目前尚不清楚。本研究旨在分析miR-497是否通過抑制THP-1巨噬細胞NLRP1，促進膽固醇流出。

1 材料與方法

1.1細胞培養和泡沫細胞形成 人THP-1單核細胞購自美國ATCC公司。將細胞在含有10%胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)均購自美國Sigma-Aldrich公司的RPMI1640培養基(美國HyClone公司)中培養。將細胞培養在含有5% CO2的37℃加濕培養箱中。對于實驗，將細胞以1.0×105個細胞/ml的密度接種在35 mm培養皿或96孔板中，并通過加入100 ng/ml佛波酯孵育細胞24 h，使其誘導分化成巨噬細胞。通過向含有0.3%牛血清白蛋白(BSA，美國HyClone公司)的無血清RPMI1640培養基中加入100 μg/ml的氧化型LDL(Ox-LDL)(美國Sigma-Aldrich公司)將巨噬細胞轉化為泡沫細胞。

1.2miR-497 mimic和載體轉染與分組 收集Ox-LDL誘導分化的巨噬細胞源性泡沫細胞，用脂質體2000轉染試劑(美國Sigma-Aldrich公司)，將不同濃度(20、40、60、80、100、120 nmol/L)miR-497 mimic轉染入細胞。加入亂碼miR-497作為對照。將細胞在37℃下孵育12 h，隨后收集細胞并進行細胞活力檢測。收集Ox-LDL誘導分化的巨噬細胞源性泡沫細胞，用脂質體2000轉染試劑(美國Sigma-Aldrich公司)，將80 nmol/L miR-497 mimic轉染入細胞，處理不同時間(12 h、24 h、48 h)后，收集細胞并進行細胞活力、Western印跡、油紅O和Dil ox-LDL染色檢測。將80 nmol/L miR-497 mimic轉染入細胞處理0 h作為對照組。

為了考察miR-497和NLRP1之間的關系，將細胞分為3′UTR-WT組、3′UTR-WT+亂碼miR-497組、3′UTR-WT+miR-497 mimic組、3′UTR-MUT+亂碼miR-497組和3′UTR-MUT+miR-497 mimic組。其中，3′UTR-WT組、3′UTR-WT+亂碼miR-497組、3′UTR-WT+miR-497 mimic組分別將包含NLRP1的3′UTR-WT載體單獨或與亂碼miR-497、miR-497 mimic轉染巨噬細胞源性泡沫細胞；3′UTR-MUT+亂碼miR-497組和3′UTR-MUT+miR-497 mimic組分別將包含NLRP1的3′UTR-MUT載體與亂碼miR-497、miR-497 mimic轉染巨噬細胞源性泡沫細胞。在轉染后24 h，測定熒光素酶活性。

為了考察miR-497 mimic轉染對NLRP1表達影響，將細胞分為：對照12 h組、miR-497 mimic 12 h組、對照24 h組、miR-497 mimic 24 h組、對照48 h組和miR-497 mimic 48 h組。對照12 h組、對照24 h組、對照48 h組分別用亂碼miR-497轉染巨噬細胞源性泡沫細胞12 h、24 h、48 h。miR-497 mimic 12 h組、miR-497 mimic 24 h組、miR-497 mimic 48 h組分別用miR-497 mimic轉染巨噬細胞源性泡沫細胞12 h、24 h、48 h。收集細胞并進行Western印跡檢測和實時熒光定量(RT-qPCR)分析NLRP1表達情況。

1.3細胞活力測定 使用CCK-8測定法(北京碧云天生物技術公司)評估細胞存活率。將上述處理的THP-1單核細胞小心地除去培養基，并向每個孔中加入100 μl含有CCK-8(RPMI1640培養基和CCK-8體積比為9∶1)的培養基。在37℃在黑暗中溫育1 h后，用SynergyHT多功能酶標儀(美國Winooski公司)測量每個孔在450 nm的光密度。

1.4膽固醇流出評估 油紅O和Dil Ox-LDL染色用于檢測細胞中的脂質積累和膽固醇流出情況。對于油紅O染色，將細胞用新鮮稀釋的0.5%油紅O溶液在37℃染色10 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，使細胞可視化并在IX-71熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下拍照。對于Dil Ox-LDL染色，將THP-1巨噬細胞與30 μg/ml用RPMI1640培養基稀釋的Dil Ox-LDL在37℃黑暗中溫育6 h。用PBS洗滌2次后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。根據制造商的方案，使用膽固醇流出熒光測定試劑盒(美國Biovision公司)定量細胞中的膽固醇流出量。通過將培養基的熒光強度除以細胞裂解物和培養基的總熒光強度來計算處理的膽固醇流出量。

1.5Western印跡分析 使用RIPA裂解緩沖液從細胞中提取總蛋白質。使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(北京碧云天生物技術公司)評估收集的蛋白質的濃度。在聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，將蛋白質樣品(50 μg)轉移到聚偏氟乙烯膜上。用含有5%低脂牛奶的Tris緩沖鹽-吐溫20(TBST)封閉緩沖液封閉后，將膜與針對NLRP1、CD36、白細胞介素(IL)-1β、IL-18及3-磷酸甘油醛胱氫酶(GAPDH)(1∶1 000)的一抗(美國Cell Signaling Technology公司)在4℃溫育過夜。用TBST洗滌后，將膜與辣根過氧化物酶耦聯的二抗〔(1∶8 000)購自美國Abcam公司〕在室溫下孵育2 h。再次用TBST洗滌后，使用增強的化學發光試劑檢測免疫復合物。使用Bio-Rad Quantity One軟件(美國Bio-Rad Laboratories公司)定量蛋白質條帶。

1.6熒光素酶報告基因探討miR-497與NLRP1的直接作用 使用引物5′-TCCGAGCTCCACCCTAGCCAATGTCTCCT-3′和5′-TGCTCTAGAGGAGCTGAA-GGCTTCTCAAA-3′通過PCR擴增含有推定的miR-497靶位點的NLRP1的野生型3′非翻譯區(3′UTRWT)的片段。同時通過使用Quik變化誘變試劑盒(德國Stratagene公司)對pGL3-NLRP1-3′ UTR載體上帶有的miR-497靶點序列中的seed sequence序列進行點突變。隨后，將包含NLRP1的3′UTR-WT(野生型)或3′UTR-MUT(突變型)片段插入緊鄰熒光素酶基因序列下游的psiChECK-2載體(美國Promega公司)中。將載體單獨或與亂碼miR-497、miR-497 mimic轉染巨噬細胞源性泡沫細胞。在轉染后24 h，通過使用K801-200熒光素酶測定試劑盒(美國Biovision公司)測定熒光素酶活性。

1.7RT-qPCR分析 使用RNA提取試劑盒(美國Promega Corporation公司)提取細胞的總RNA。使用30 ng總RNA和1 μmol/L環狀引物進行逆轉錄反應。反應條件如下：85℃ 5 min，4℃ 5 min。通過MX3000p實時PCR檢測系統(美國Stratagene公司)使用標準SYBR Green Assay方案進行實時PCR。 25 μl PCR包括2 μl逆轉錄產物，1×PCR Master Mix(日本Takara公司)，1.5 μmol/L正向引物和0.7 μmol/L反向引物。將反應物在96孔板中于95℃溫育10 s，然后進行40個循環，95℃ 5 s，60℃ 30 s。通過2-Ct計算每個基因的相對表達，并用GAPDH進行歸一化。用于qPCR擴增的引物序列如下：NLRP1正向引物：5′-CTGTCGCTTCTCAAT CAGACTC-3′；反向：5′-CCCAGGTCATTTCCCATC-ACTT-3′，β-actin正向引物：5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′；反向：5′-AGGAAGGAAGGCTGGAA-GAG-3′。

1.8統計學處理 所有實驗獨立重復至少3次。采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析和獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各種處理后的細胞活力 為了選擇最佳轉染條件，使用CCK-8測定不同處理后細胞活力。對照組、miR-497 mimic濃度分別為20、40、60、80、100、120 nmol/L組轉染THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的細胞活力分別為(100.0±1.2)%、(99.6±1.7)%、(97.8±1.8)%、(96.1±1.7)%、(94.2±1.5)%、(82.3±2.0)%、(74.4±1.8)%。80 nmol/L miR-497 mimic轉染對照組、12 h組、24 h組、48 h組后，THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的細胞活力分別為(101.3±1.1)%、(100.1±1.8)%、(99.7±1.5)%、(100.0±1.7)%。結果顯示，miR-497 mimic轉染濃度80 nmol/L是安全的，并且隨著轉染時間的增加對細胞存活率沒有顯著影響，而miR-497 mimic濃度在100、120 nmol/L下存活率較對照組顯著降低(P<0.05)。因此，選擇miR-497 mimic轉染濃度80 nmol/L作為研究條件。

2.2miR-497 mimic轉染對細胞膽固醇流出的影響 與對照組相比，miR-497 mimic轉染后24 h，細胞中的脂質儲存顯著下降(P<0.05)。轉染后24 h開始紅色熒光減弱，定量分析顯示miR-497 mimic轉染后24 h和48 h的膽固醇流出量顯著高于對照組(P<0.05)。見表1、圖1。表明miR-497 mimic轉染促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的膽固醇流出。

2.3miR-497 mimic轉染對促炎細胞因子釋放的影響 與對照組相比，不同miR-497 mimic轉染時間組顯著降低了THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞NLRP1的表達(P<0.05)，并且CD36和IL-1β、IL-18等促炎因子的表達顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。這種降低呈時間依賴性。

2.4NLRP1是miR-497的靶基因 根據TargetScan在線分析軟件，發現NLRP1和miR-497序列之間存在一個序列特異性結合域，NLRP1是miR-497的靶基因，其結合位點位于NLRP1的3′非翻譯區(UTR)上，該靶基因已通過熒光素酶分析驗證。熒光素酶報告基因檢測3′UTR-WT組、3′UTR-WT+亂碼miR-497組、3′UTR-WT+miR-497 mimic組、3′UTR-MUT+亂碼miR-497組、3′UTR-MUT+miR-497 mimic組熒光素酶活性分別為1.00±0.08、1.02±0.09、0.38±0.07、0.96±0.06、0.91±0.05。結果表明，與3′UTR-WT+miR-497 mimic組相比，3′UTR-MUT+miR-497 mimic組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與3′UTR-WT組相比，3′UTR-WT+miR-497 mimic組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，但對突變型3′UTR的熒光素酶活性無明顯抑制作用，說明miR-497能特異性地與NLRP1-3′UTR結合。miR-497 mimic轉染對照12 h組、miR-497 mimic 12 h組、對照24 h組、miR-497 mimic 24 h組、對照48 h組、miR-497 mimic 48 h組后，NLRP1 mRNA/β-actin分別為1.02±0.08、0.68±0.05、1.01±0.06、0.42±0.04、1.01±0.05、0.36±0.04。qRT-PCR分析結果顯示，與對照組相比，miR-497 mimic可顯著抑制NLRP1蛋白和NLRP1 mRNA的表達(P<0.05)。見圖3。這種抑制作用呈時間依賴性。

3 討 論

巨噬細胞源性泡沫細胞是AS斑塊的重要組成部分。這種細胞類型在壞死核的形成和慢性炎癥的形成中起著至關重要的作用，導致AS斑塊的進展和不穩定〔9〕。因此，抑制巨噬細胞源性泡沫細胞中脂質沉積至關重要。miRNA是一類短的非編碼RNA，已成為AS中膽固醇代謝的關鍵調節因子〔10〕。miRNA通過與靶序列的3′UTR結合來抑制mRNA表達，導致靶基因翻譯減少或mRNA降解增加〔11〕。本研究中，miR-497 mimic(模擬物)促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的膽固醇流出，并且可靶向抑制NLRP1表達，抑制促炎細胞因子產生。

MiR-497屬于miR-15/16/195/424/497家族，其成員共享相同的3′-UTR種子序列。miR-497位于人類染色體17p13.1中，幾乎存在于所有人體器官和組織中，包括腦、肝臟、心臟和血液〔12〕。miR-497的過度表達增強了細胞分裂、代謝及降低促炎細胞因子釋放。王娟娟等〔13〕采用基因芯片分析miR-497高表達對結腸癌細胞HCT116基因表達譜的影響，結果發現miR-497抑制結腸癌細胞HCT116中炎癥相關基因mRNA的表達。曹琳等〔14〕研究發現急性腦梗死患者外周血miRNA-497的表達與腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-10水平呈負相關。在這項研究中，NLRP1被證明是miR-497的靶基因，并且過表達的miR-497可顯著抑制巨噬細胞源性泡沫細胞中NLRP1 mRNA的表達。

NLRP1炎癥小體是一個以NLRP1為基礎的分子平臺，廣泛存在于巨噬細胞、T細胞及單核細胞等細胞中，它控制促炎細胞因子IL-1β和IL-18的成熟〔15〕，在AS的發病機制中起重要作用〔5〕，但其機制尚未完全闡明。泡沫細胞的形成被認為是AS起始階段的標志，并且與AS的發生發展密切相關〔16〕。以往的研究表明，NLRP1炎性體影響巨噬細胞源性泡沫細胞的產生，但結果是有爭議的。Li等〔17〕發現腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)激活NLRP炎癥小體加速小鼠骨髓巨噬細胞脂質沉積；喻思揚等〔5〕觀察到NLRP1炎性體及其下游細胞因子對Ox-LDL誘導的THP-1細胞和人外周血單個核細胞的泡沫細胞形成的抑制作用。相反，Steverson等〔18〕報道NLRP1的沉默增強了巨噬細胞中膽固醇的積累。本研究發現，miR-497 mimic轉染后細胞內脂質沉積顯著下降，而膽固醇流出在對照組(亂碼miR-497對照組)中不太明顯。這證實了NLRP1炎性體阻斷對巨噬細胞中細胞內脂質積累的正調節作用。目前關于NLRP1炎性體如何影響巨噬細胞中膽固醇體內平衡知之甚少。已知在巨噬細胞源性泡沫細胞形成過程中，Ox-LDL的攝取主要受CD36介導，而CD36的活化由NLRP1炎性體加工的細胞因子IL-1β和IL-18誘導〔19〕。有研究證實IL-1β和IL-18水平降低引起CD36表達的顯著抑制〔20〕。本研究發現，經miR-497 mimic轉染后，THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中的NLRP1、CD36、IL-1β和IL-18表達均較對照組顯著降低。上述結果提示，泡沫細胞中的膽固醇流出可能與NLRP1炎性體的抑制有關。

綜上，miR-497通過靶向抑制THP-1巨噬細胞NLRP1，促進膽固醇流出，并抑制THP-1巨噬細胞中細胞內脂質的積累。然而，本研究主要集中在miR-497在細胞水平上的作用，而miR-497對AS的影響需要在動物模型中進一步研究。