右美托咪定對高糖誘導大鼠海馬神經元損傷的保護作用

趙偉新 王朋飛 夏貴山 敬廣霞

(鄭州市中心醫院，河南 鄭州 450000)

糖尿病治療不當會引起一系列糖尿病慢性并發癥，危害機體心臟、大腦、腎臟等多個器官〔1,2〕。糖尿病腦病是公認的一種糖尿病慢性并發癥，即由糖尿病代謝紊亂引起的中樞神經損傷〔3〕。糖尿病腦病主要導致語言、認知和運動功能障礙，臨床表現為短期記憶缺陷、理解能力下降、行動遲緩等〔4,5〕。目前有研究報道糖尿病腦病與海馬神經元凋亡具有密切關系〔6〕，因此尋找一種有效抑制海馬神經元凋亡的藥物對于糖尿病腦病的深入研究具有非常重要的意義。右美托咪定是一種α2-腎上腺素受體激動劑，具有鎮痛、鎮靜、抑制交感神經活性等作用〔7〕，近年來有研究顯示右美托咪定也具有神經保護作用〔8〕。本文擬對右美托咪定在高糖誘導的神經元損傷中是否具有保護作用及機制進行研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑儀器 SPF級SD大鼠10只購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重5～10 g，雌雄各半，生產許可證號：SCXK(京)2019-0009；控制SPF屏障內溫度為20～25℃，濕度為50%～70%。本實驗室對SD大鼠的處理符合實驗動物福利及倫理規范。

DMEM培養液(31600034)、胎牛血清(FBS)(16000-044)、胰蛋白酶(25200-056)等購自Gibco公司；細胞計數(CCK)-8試劑盒(4020ES60)購自上海翊圣生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(PT0001)購自北京雷根生物技術有限公司；TUNEL檢測試劑盒(C1088)、Hoechst 染色液(C1018)購自碧云天生物技術有限公司；總蛋白提取試劑盒(78510)購自Thermo公司；GAPDH單抗(ab181602)、神經元特異核蛋白(NeuN)抗體(ab104224)、突觸素(SYP)抗體(ab184176)、活化胱天蛋白酶(cleaved cas)-3抗體(ab13847)、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2抗體(ab182858)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體(ab32503)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白抗體(ab38449)、Akt蛋白抗體(ab18785)、磷酸化信號傳導與轉錄激活因子(p-STAT3)蛋白抗體(ab76351)、STAT3蛋白抗體(ab119352)等兔源多抗及異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔熒光二抗(ab6717)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(ab6721)均購自Abcam。

倒置熒光顯微鏡(Olympus IX70)；臺式高速冷凍離心機(Eppendorf centrifuge,5415R)；PCR儀(Bio-Rad,S1000)；超低溫冰箱(HISENSE)；蛋白凝膠成像儀(Thermo)；細胞恒溫CO2培養箱(SANYO)；其他常規儀器均由本實驗室提供。

1.2原代大鼠海馬神經元細胞培養 脫頸處死出生24 h內的SD大鼠，置于75%酒精中浸泡消毒10 min，置于冰盒上操作。分層剪開頭部皮膚和顱骨，暴露雙側大腦，用眼科鑷分開大腦皮層，暴露雙側海馬組織，分離出新月形海馬組織后置于事先加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)的細胞培養皿中，剔除海馬組織中血管和腦膜組織后，將其剪成1 mm3的小碎塊，隨后轉移至2 ml離心管中，加入胰蛋白酶置于37℃培養箱中消化10 min，期間振蕩2～3次，待消化液變渾濁且不見組織塊時終止消化。1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入2 ml DMEM培養液再次離心5 min，棄上清液后用加入10%FBS及雙抗的DMEM培養液重懸沉淀，輕輕吹打混勻，轉移至細胞培養瓶中置于37℃、5%CO2培養箱中培養，24 h后更換全部培養液，之后每2～3 d進行半量換液培養。

1.3免疫熒光試驗鑒定海馬神經元 待海馬神經元細胞培養至第12天時，將其接種至24孔板中(孔內提前放入爬片)培養24 h后對其進行鑒定。棄掉細胞培養液，PBS洗滌3次，預冷的4%多聚甲醛固定30 min后，PBS再沖洗3次，加入預冷的甲醇室溫透化10 min，PBS再沖洗3次，加入5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉45 min，棄掉封閉液，加入1∶1 000稀釋的NeuN單抗，室溫孵育1 h，回收一抗后PBS沖洗3次，加入1∶5 000稀釋的FITC標記的羊抗兔熒光二抗避光孵育1 h，棄二抗，加入1∶500稀釋的鬼筆環肽，37℃孵育50 min，PBS清洗3次，加入1 μg/ml的DAPI染料，避光作用15 min，棄掉DAPI，PBS沖洗3次，最后加入少許PBS，將爬片轉移至載玻片上置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4CCK-8試驗 分組及處理：制備海馬神經元細胞懸液，將細胞懸液隨機分為3組，參考相關文獻〔9〕分別給予100 mmol/L葡萄糖處理(高糖組)、400 μmol/L右美托咪定與100 mmol/L葡萄糖共同處理(高糖+右美托咪定組)及不做任何處理(對照組)置于培養箱中培養24 h后進行后續試驗。分別制備各組細胞懸液并進行細胞計數，將細胞懸液加入96孔板中，每孔加100 μl，用培養液做10倍倍比稀釋，共設置5個細胞濃度梯度，同時每個樣本設置3個重復，置于37℃、5%CO2培養箱中預培養24 h。向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，培養箱中培養1～4 h，置于酶標儀中測定其在450 nm波長處的吸光度。

1.5TUNEL試驗 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進行后續試驗。首先進行Hoechst活細胞染色，將各組處理后的細胞懸液計數，將106個細胞懸浮于1 ml含有10%FBS的培養液中，加入10 μl Hoechst 染色液混勻后置于37℃培養箱中培養10 min，將細胞置于冰上冷卻，4℃離心后棄上清，將細胞用培養液重懸接種于24孔板中(提前放入爬片)，進行后續TUNEL染色。

參照TUNEL檢測試劑盒說明書進行試驗。待細胞長滿爬片的70%～80%后取出爬片，室溫晾干固定20 min，PBS沖洗3次，每次5 min。封閉液室溫封閉10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。通透液室溫透化2 min，在濕盒中進行后續標記反應。PBS沖洗細胞爬片并用濾紙吸干周圍洗液，每個樣本加入100 μl末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)酶反應液，置于細胞培養箱中孵育60 min。20×檸檬酸鈉緩沖液(SSC)終止反應，室溫靜置15 min，PBS沖洗3次，每次5 min。將爬片置于0.3%H2O2/PBS中室溫封閉5 min，PBS沖洗3次。加入100 μl HRP標記的鏈霉素和素(Streptavidin-HRP)工作液，置于37℃細胞培養箱中孵育60 min，PBS沖洗3次。加入3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色液，去離子水沖洗數次后用中型樹膠封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.6免疫熒光試驗檢測SYP蛋白表達 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進行后續試驗。免疫熒光試驗封閉操作前的具體方法同1.3，封閉后加入1∶1 000稀釋的兔源SYP多抗，室溫孵育1 h，回收一抗后PBS沖洗3次，加入1∶5 000稀釋的FITC標記的羊抗兔熒光二抗避光孵育1 h，棄二抗，PBS清洗3次，加入1 μg/ml的DAPI染料，避光作用15 min，棄掉DAPI，PBS沖洗3次，最后加入少許PBS，將爬片轉移至載玻片上置于熒光顯微鏡下觀察。

1.7實時熒光定量(qRT)-PCR檢測mRNA表達 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進行后續試驗。取處于對數生長期的細胞接種至6孔板中，細胞接種量為2.5×105個細胞。通過Trizol法提取細胞中的總RNA，逆轉錄成cDNA。然后進行PCR擴增。以GAPDH為內參，通過 法計算SYP mRNA相對表達量。具體引物序列：SYP上游引物：5′TCCAATCAGATGTAGTCTGGTCAG3′、下游：5′AGGCCTTCTCCTGAGCTCTT3′；GAPDH上游引物：5′AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3′、下游：5′AGGGGCCATCCACAGTCTTC3′。

1.8Western印跡檢測蛋白表達 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進行后續試驗。按照總蛋白提取試劑盒說明書操作提取細胞總蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白定量后渦旋混勻，置于沸水浴中煮樣10 min，存放于-80℃備用。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳時濃縮膠電壓為90 V，分離膠電壓為120 V，電泳結束后采用恒流轉印，將蛋白轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉印條件為恒流250 mA，1～2 h。轉膜后TBST洗膜3次，5%脫脂乳封閉1 h，分別加入GAPDH單抗、SYP、cleaved cas-3、Bcl-2、Bax、p-Akt、Akt、p-STAT3和STAT3的兔源多抗，稀釋倍數均為1∶1 000，室溫孵育4～6 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入1∶5 000稀釋的HRP標記二抗室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。顯色液顯色，置于蛋白凝膠成像儀下分析目的蛋白的相對含量。

1.9統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1海馬神經元的鑒定 原代培養的海馬神經元采用NeuN蛋白進行特異性標記，免疫熒光結果顯示，NeuN蛋白主要表達在細胞核，且NeuN呈強陽性蛋白，表達強度為(93.21±3.01)%。見圖1。

2.2右美托咪定抑制高糖誘導的神經元細胞活力的降低 與對照組〔(102.77±5.19)%〕相比，高糖組神經元細胞的存活率顯著降低〔(70.59±6.75)%，P<0.05〕；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經元細胞的存活率〔(89.27±5.19)%，P<0.05〕顯著升高。

2.3右美托咪定抑制高糖誘導的神經元細胞凋亡 與對照組〔(4.02±0.98)%〕相比，高糖組神經元細胞凋亡率〔(28.12±3.71)%，P<0.05〕顯著升高；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經元細胞的凋亡率〔(11.30±2.04)%，P<0.05〕顯著降低。見圖2。與對照組相比，高糖組神經元細胞cleaved cas-3、Bax蛋白顯著升高,Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經元細胞cleaved cas-3、Bax蛋白顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖3。

2.4右美托咪定促進突觸素蛋白和mRNA表達 與對照組相比，高糖組神經元細胞SYP蛋白及mRNA顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經元細胞SYP蛋白及mRNA顯著升高(P<0.05)。見表1、圖4、圖5。

2.5右美托咪定激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路 與對照組相比，高糖組神經元細胞p-Akt和p-STAT3蛋白顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經元細胞p-Akt和p-STAT3蛋白顯著升高(P<0.05)。各組Akt和STAT3蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖6。

3 討 論

糖尿病腦病與海馬神經元損傷密切相關，具體表現為高糖可導致機體代謝紊亂、血液黏稠度升高、血管內皮細胞損傷等〔10,11〕，進而引發大腦供血不足，造成與認知有關的大腦海馬神經元損傷〔12〕。臨床上對于糖尿病腦病所引起的神經元損傷治療大多以藥物控制為主，但目前所用的藥物存在較為嚴重的副作用。右美托咪定是一種主要作用于神經系統的藥物，臨床上多與鎮靜藥物等聯合使用進行麻醉，具有良好的抑制交感神經活性作用〔13〕，且近期有研究顯示右美托咪定對神經性疾病具有良好的治療效果〔14〕。本研究表明右美托咪定能有效抑制高糖誘導的大鼠海馬神經元細胞活性降低和細胞凋亡，對于高糖誘導的神經元損傷具有保護作用。

cas-3蛋白是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，cleaved cas-3是其活化后被剪切產生的活性片段，具有蛋白水解酶的作用，能夠促使細胞凋亡〔15〕。Bcl-2家族在調控細胞凋亡過程中具有重要作用，Bcl-2蛋白是抗凋亡基因，可降低細胞內氧化還原電位從而抑制細胞凋亡〔16〕。Bax則是凋亡促進基因，可以和Bcl-2結合形成二聚體抑制Bcl-2的抗凋亡作用〔17〕。本研究表明右美托咪定具有對抗高糖引起的大鼠海馬神經元細胞凋亡的作用。

SYP是主要存在于海馬神經元突觸前膜的囊泡中的一種糖蛋白，與突觸功能和結構密切相關〔18,19〕。據報道，SYP表達能夠反映突觸的再生和重構能力，神經元損傷后導致突觸功能異常或喪失，進而引發嚴重的認知功能障礙〔20〕。本研究進一步驗證了右美托咪定能夠抑制高糖導致的大鼠海馬神經元損傷。

有研究報道，某些藥物治療對腦損傷具有保護作用，而該過程是在PI3K/Akt信號通路激活的參與下完成的，其中的機制為：抑制Akt蛋白的磷酸化能夠加重神經元損傷患者的認知和記憶損傷，反之，促進Akt蛋白磷酸化則能顯著抑制信號通路中Bax蛋白的表達上調，進而抑制細胞凋亡發生〔21〕。JAK2/STAT3信號通路是一條參與細胞增殖、凋亡和炎癥等多個生理和病理過程的重要信號通路〔22〕，李霞等〔23〕觀察STAT3被激活后能夠有效抑制神經細胞凋亡，當JAK2/STAT3信號通路受到抑制且STAT3磷酸化被干擾時會加重神經元損傷。本研究結果表明，應用右美托咪定后，PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路被激活并增加p-Akt和p-STAT3表達量，但右美托咪定是否通過這兩條信號通路發揮保護神經元細胞作用及這兩條信號通路的具體信號轉導和通路間的相互關系還需深入研究。

綜上，右美托咪定對高糖誘導的大鼠海馬神經元損傷具有保護作用，右美托咪定可以激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路，推測右美托咪定可能通過激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路對高糖誘導的大鼠海馬神經元損傷發揮保護作用。