山楂原花青素及維生素C對胰島素抵抗大鼠肝臟炎癥反應的影響

李西棟 紀雨含 韓富磊 梁亞楠 宓偉

(1臨沂市人民醫(yī)院心血管內科，山東 臨沂 276000；2濱州醫(yī)學院公共衛(wèi)生與管理學院)

低度肝臟炎癥反應與引發(fā)的胰島素抵抗(IR)和2型糖尿病等代謝性疾病密切相關〔1〕。有研究表明，肝臟炎癥反應是引發(fā)IR的重要機制〔2〕。促炎癥因子如白細胞介素(IL)-1α、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等炎癥因子在脂肪組織中的濃度升高，其在血漿中的濃度也明顯高于正常水平，它們通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)、κB抑制蛋白激酶(IKK)-β、細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、蛋白激酶(PK)C、核糖體蛋白S6激酶(S6K)1等炎癥信號，誘導機體產生IR〔3～5〕。長期高脂飲食會導致胰島素介導的相關作用減弱，如脂解抑制作用，這時血漿中游離脂肪酸(FFA)濃度會明顯升高，促使肝臟生成內源性葡萄糖，胰島素不能有效抑制肝糖原的合成，從而導致肝臟發(fā)生IR，引起血糖升高〔6，7〕，肝臟組織是機體炎癥反應和IR的主要器官，因此研究肝臟炎癥反應對IR的發(fā)生機制具有重要意義。山楂原花青素(HPC)是由不同數量的兒茶素和表兒茶素縮合而成的多酚類低聚化合物，廣泛存在于山楂果中。HPC具有清除自由基、降血壓、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學活性，近年來廣泛用于食品和藥物的開發(fā)〔8〕。維生素C(VC)又稱抗壞血酸，廣泛存在于新鮮蔬菜水果中，是血漿中最有效的抗氧化劑，其與各種氧自由基迅速反應，有效清除氧自由基，從而達到抗氧化的作用〔9〕。本研究探討HPC和VC聯合用藥對IR模型大鼠肝臟炎癥反應的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 Wistar大鼠90只，雄性，由濱州醫(yī)學院實驗動物中心提供，體質量(190±16)g，6～8周齡，SPF級，合格證號SCXK(魯)2015-0006。適應性常規(guī)飼料喂養(yǎng)1 w后用于實驗。

1.2藥物與試劑 主要藥物及試劑為：羅格列酮(成都恒瑞制藥有限公司，批號H20060578)；HPC(質量分數為95%，中國西安綠天生物技術有限公司，批號20150402)；VC(華南藥業(yè)集團有限公司，批號H44020774)；兔抗鼠磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)抗體和兔抗鼠p-PI3K、p-AKT、核轉錄因子(NF)-κB(美國Cell Signaling Technology公司)；兔抗鼠β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗體(美國Millipore公司)；TNF-α、IL-8、IL-4、IL-10、FFA酶聯名史疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒，NE-PERTM試劑盒(美國Millipore公司)；Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix：(Thermo Fisher Scientific)，其他試劑均為國產分析純。

1.3儀器 TGL-16M高速冷凍離心機(上海赫田科學儀器有限公司)；SpectraMax i3x 多功能酶標儀(Molecular Devices)；DYY-6D 電泳儀、DYCZ-24A雙垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；RE-5298A旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮儀器廠)；Prism 7500反轉錄(RT)聚合酶鏈反應(PCR)儀(美國Applied Biosystems公司)；212 PRO凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Kodak公司)；HFJ-25高速勻漿機(德國Ika公司)。

1.4實驗動物分組 將90只大鼠隨機分為對照組(10只)和高脂飲食組(80只)。對照組給予普通飼料(玉米73.5%、麥麩20%、魚粉5%、谷粉1%、食鹽0.5%)，高脂軟食組給予高脂飼料(普通飼料78.8%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油 10%)，同時喂養(yǎng)6個月，通過尾靜脈測定空腹血糖≥7.0 mmol/L者為造模成功，共造模成功58只〔10〕設為IR組。造模前后稱體重，檢測兩組造模前后的體重變化。造模后，禁食1夜，次日上午斷尾取血1 ml，檢測大鼠空腹血糖，同時眼眶靜脈取血，離心取上清，分別檢測血清胰島素水平和丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性。選取造模成功的50只IR大鼠隨機分為模型組(0.9%生理鹽水)、HPC(56 mg/kg)組、VC(180 mg/kg)組、HPC(56 mg/kg)+VC(180 mg/kg)組和羅格列酮(2 mg/kg)組各10只。等體積灌胃給藥(20 ml)，每天給藥1次，持續(xù)20 w。

1.5指標檢測 最后1次喂養(yǎng)大鼠不禁水但禁食10 h，于眼球取血，4 000 r/min離心8 min，取上清經生理鹽水1∶5稀釋后，-20℃低溫保存，并采取大鼠的肝臟組織。參照ELISA試劑盒方法測定血清中的促炎癥因子TNF-α、IL-8和抗炎癥因子IL-8、IL-10的水平；參照ELISA試劑盒的方法測定血清和肝臟中FFA的含量。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色制備肝組織病理切片 取大鼠新鮮肝臟組織，用10%的甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋；將修整好的石蠟塊置于石蠟切片機上連續(xù)切片，片厚約3 μm，置烤箱65℃干燥，貼附30 min；肝組織石蠟切片脫蠟至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、85%、75%酒精各5 min，流水沖洗；蘇木素染色3～5 min，流水沖洗至切片顏色發(fā)藍，1%鹽酸酒精分化3 s立即取出，流水沖洗，0.5%伊紅復染10 s，流水沖洗；梯度酒精脫水后中性樹膠封片，晾干，光學顯微鏡觀察。

1.7Western印跡檢測肝組織PI3K、AKT磷酸化程度和C-NF-κB、N-NF-κB蛋白表達量 取大鼠新鮮肝臟組織100 mg，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液清洗兩次，棄掉PBS液，在肝臟組織中加入2 ml的裂解液裂解細胞，冰浴中低速勻漿提取肝組織中的總蛋白，7 500 r/min離心5 min取上清備用。生理鹽水洗滌肝組織，勻漿，研磨，冰上膨脹裂解15 min，之后震蕩10 s，12 000 r/min，轉移上清即胞質蛋白。加入生理鹽水到沉淀中，重懸浮細胞核，冰上裂解20 min，不時攪動，之后12 000 r/min離心10 min，取上清，即為核蛋白，低溫冷凍保存〔11〕。取60 μg總蛋白(包括提取的細胞質和細胞核)加入4×蛋白上樣液，使用DYY-6D 電泳儀進行電泳分離，電泳分離后將蛋白條帶立即移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，按順序依次加入一抗(兔抗鼠PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB多克隆抗體，β-actin小鼠多克隆抗體)及相應二抗，洗滌后，用電化學發(fā)光(ECL)系統(tǒng)對相應的蛋白條帶進行檢測，對底片進行曝光、顯影、定影。洗片后，用Quanlity One軟件掃描各蛋白條帶，測定其蛋白灰度值。以β-actin為內參對基因的相對表達量進行定量分析，以對應的總蛋白對磷酸化蛋白的相對表達量進行半定量分析，實驗重復5次。

1.8RT-PCR檢測肝組織炎癥因子mRNA的表達 取小鼠肝臟100 mg，加入600 ml Trizol，低速勻漿破碎細胞，提取總RNA。將RNA 溶于0.3 ml焦碳酸二乙酯(DEPC)水，取適量稀釋，測定吸光度值A260和A280，并計算溶解后RNA的純度和含量。取1 μg總RNA在M-MLV逆轉錄酶的催化作用下逆轉錄成cDNA。cDNA于25 ml的反應體系中擴增，各反應物用量參照Maxima SYBR Green qRT-PCR Master mix說明書要求，反應體系包括：cDNA模版6 μl，Maxima SYBR Green qRT-PCR Master mix 12.5 μl，上、下游引物各0.3 μl，超純水5 μl。反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)。目的基因mRNA表達量均以β-actin mRNA的量作為內參校正，將正常對照組定為1個單位，實驗重復5次。炎癥因子各引物序列為：TNF-α：正向引物：5′-ATCCGCGACGTGGAACTG-3′，反向：3′-ACCGCCTGGAGTTCTGGAA-5′；IL-8正向引物：5′-CAAGGCTGGTCCATGCTCC-3′，反向：3′-CGTTGTCTTTCCTTCACTACTGT-5′；IL-4：正向引物：5′-GCTATTGATGGGTCACCC-3′，反向：3′-AGGACATGGAACTGCAGGAC-5′；IL-10：正向引物：5′-GGTTGCCAAGCCTTATCGGA-3′，反向：3′-TCGTTCCGTCACCTCGTCCA-5′。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結 果

2.1IR大鼠造模結果 共有58只大鼠造模成功，設為IR組。與對照組比較，IR組體重顯著升高(P<0.01)，血糖及血清胰島素、ALT、AST和ALP水平均顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.2各組血清炎癥因子的檢測結果對比 與對照組比較，模型組血清中TNF-α 和IL-8水平顯著增加，IL-4和IL-10水平顯著降低(均P<0.01)。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組TNF-α和IL-8濃度顯著降低，而IL-4和IL-10濃度顯著升高(均P<0.01)。見表2。

2.3各組血清和肝臟中FFA檢測結果對比 與對照組比較，模型組血清和肝臟中FFA水平顯著增加(均P<0.01)。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組血清和肝臟中FFA濃度顯著降低(均P<0.01)。見表2。

2.4各組肝組織炎性病理反應對比 與對照組比較，模型組肝細胞存在脂肪變性，血管旁存在大量炎癥細胞浸潤。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組脂肪變性明顯減輕，炎細胞浸潤顯著改善。見圖1。

2.5各組肝組織PI3K、AKT磷酸化程度 與對照組比較，模型組肝組織PI3K、AKT磷酸化程度顯著增加(均P<0.01)；與模型組和HPC組比較，HPC+VC組肝組織PI3K、AKT磷酸化程度顯著降低(均P<0.01)。見圖2、表3。

表3 各組肝組織PI3K磷酸化和AKT磷酸化程度

2.6各組肝組織NF-κB蛋白相對表達量 與對照組比較，模型組C-NF-κB蛋白表達量顯著降低，N-NF-κB蛋白表達量顯著增加(P<0.01)。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組C-NF-κB蛋白表達量顯著增加，N-NF-κB蛋白表達量顯著降低(P<0.01)。見圖3、表4。

2.7各組肝組織炎癥因子mRNA的表達 與對照組比較，模型組血清中TNF-α 和IL-8 mRNA相對表達量顯著增加，IL-4和IL-10 mRNA相對表達量顯著降低(均P<0.01)。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組TNF-α和IL-8 mRNA相對表達量顯著降低，IL-4和IL-10 mRNA相對表達量顯著升高(均P<0.01)。見表4。

3 討 論

糖尿病發(fā)生IR時，各種毒性物質、代謝物、微生物易引起肝細胞損傷、炎性細胞聚集導致非酒精性脂肪性肝病、肝細胞性肝癌等系列肝損害〔12，13〕。肝臟炎癥因子水平會影響胰島素介導的分子信號通路，造成代謝障礙而呈現胰島素敏感性降低〔14〕。

FFA作為一種內分泌介質，可以有效調節(jié)胰島素敏感性和糖脂代謝。機體攝入能量過剩時，會在體內以脂肪的形式進行儲存，若正常的生理不能調節(jié)這些過多的脂肪時，大量的FFA從脂肪細胞中溢出，機體中異常增多的FFA會刺激脂肪細胞釋放TNF-α和IL-8等促炎癥性因子，這些炎癥因子與脂肪細胞因子的受體和模式識別受體結合而干擾機體中糖脂的正常代謝，使機體的胰島素敏感性降低，誘發(fā)IR，呈現糖脂代謝紊亂狀態(tài)〔15〕。有研究表明，糖尿病患者發(fā)生肝損傷時，活性氧簇可誘導肝組織釋放TNF-α和IL-8等促炎癥因子，TNF-α通過干擾線粒體呼吸鏈，并且形成超氧陰離子而增加線粒體膜的通透性，從而加劇線粒體損傷〔16〕；TNF-α可以誘導IL-8的產生，IL-8具有明顯的趨化和激活中性粒細胞，引起血管內皮細胞損傷，使肝臟炎癥細胞浸潤更加嚴重〔17〕。本實驗結果表明，HPC+VC可顯著降低血清中促炎因子TNF-α和IL-8的水平，改善炎細胞浸潤，減輕肝細胞脂肪變性，降低肝組織損傷程度，調節(jié)糖脂代謝功能，作用效果優(yōu)于單獨使用HPC或VC。而IL-4和IL-10屬于抗炎性因子，其對于調控炎癥反應具有重要意義。NF-κB活化可引起眾多炎癥介質發(fā)生作用，活化后的NF-κB由細胞質轉移到細胞核內，影響TNF-α和IL-8等基因的轉錄和表達，誘發(fā)各種炎癥反應，活化的PI3K/AKT/NF-κB信號通路可直接或間接促進肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展。本研究結果說明HPC+VC能有效阻斷PI3K/AKT/NF-κB信號通路、抑制NF-κB活化，進而降低TNF-α、IL-8的濃度，改善肝臟炎癥損傷。可以推測HPC+VC聯合用藥可能通過PI3K/AKT/NF-κB分子信號通路改善IR大鼠的肝臟炎癥反應，又因為HPC和VC均為食物中的天然營養(yǎng)成分，無毒副作用，有一定的藥物開發(fā)和研究價值。

綜上，HPC+VC聯合用藥可明顯改善IR大鼠的肝臟炎癥反應，但HPC+VC用藥后如何作用于受體來調控PI3K/AKT/NFκB分子信號通路，目前分子機制還不清楚，還需進一步研究。