lncRNA BLACAT1通過靶向miR-374b-5p對卵巢癌細胞紫杉醇耐藥性的影響及其機制

趙磊 王一斐 薛國勇

(南陽市中心醫院 1藥劑科，河南 南陽 473000；2婦科)

卵巢癌是全球第二常見的婦科惡性腫瘤，由于卵巢惡性腫瘤早期病變多無癥狀、不易發現，約75%病例在晚期診斷出來〔1〕。化療是晚期卵巢癌的主要治療手段，紫杉醇(Taxol)在卵巢癌化療中尤為重要，其和順鉑的聯合應用已成為卵巢癌患者的標準化療方案，然而由于Taxol耐藥性的出現極大限制了其臨床應用范圍，降低其臨床療效〔2，3〕。因此，探索卵巢癌進展和耐藥的分子機制對提高卵巢癌患者的生存率至關重要。近年研究發現，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在惡性腫瘤的進展和耐藥中發揮重要作用〔4，5〕。膀胱癌相關轉錄本(BLACAT)1在胃癌奧利沙鉑耐藥組織和細胞中上調表達，抑制其表達可促進胃癌細胞凋亡，抑制細胞遷移，提高胃癌細胞對奧利沙鉑的敏感性〔6〕；BLACAT1在非小細胞肺癌順鉑耐藥和阿法替尼耐藥細胞中表達上調，干擾其表達可降低非小細胞肺癌細胞對順鉑和阿法替尼的耐藥性〔7，8〕。但BLACAT1在卵巢癌中的表達及其對卵巢癌細胞Taxol耐藥性的影響尚不清楚。miR-374b-5p在卵巢癌中表達下調，上調miR-374b-5p可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和上皮間質轉化，提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性〔9〕。生物信息學分析顯示，miR-374b-5p是BLACAT1的潛在靶基因，但BLACAT1能否通過靶向調控miR-374b-5p表達影響卵巢癌細胞Taxol耐藥性目前還尚未可知。本研旨在闡明BLACAT1對卵巢癌細胞Taxol耐藥性的影響和調控機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 收集2017年1月至2018年6月于南陽市中心醫院確診并進行手術切除的20例卵巢癌組織和與其對應的癌旁組織(距離癌灶2 cm)，患者在術前均接受化療，均簽署知情同意書。該研究經醫院倫理委員會批準。卵巢癌細胞株SKOV3購于中科院上海生命科學研究院細胞資源中心；人卵巢癌Taxol耐藥細胞株SKOV3/Taxol購于廣西醫科大學附屬腫瘤醫院；RPMI1640培養基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購于美國Gibco公司；脂質體LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司；Trizol一步法總RNA提取試劑購于上海聯碩生物科技有限公司；si-NC、si-BLACAT1、miR-NC、miR-374b-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-374b-5p、pcDNA、pcDNA-BLACAT1及WT-BLACAT1、MUT-BLACAT1的構建均由上海吉瑪制藥有限公司提供；細胞計數試劑盒(CCK)-8、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒、放射免疫沉淀試驗(RIPA)細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于上海碧云天生物技術有限公司；細胞周期蛋白(Cyclin)D1兔單克隆抗體、P21兔單克隆抗體、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2兔單克隆抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗購于美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和細胞轉染 采用RPMI1640培養基(含10%胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/ml)在37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中分別培養SKOV3和SKOV3/Taxol細胞。將SKOV3/Taxol細胞以每孔2×105個細胞的密度接種在6孔培養板，第2天利用脂質體LipofectamineTM2000分別將si-NC、si-BLACAT1、miR-NC、miR-374b-5p mimics轉染至SKOV3/Taxol細胞，轉染48 h，檢測轉染效果，進行后續實驗。為進一步驗證BLACAT1調控miR-374b-5p表達影響卵巢細胞對Taxol的耐藥性，將si-BLACAT1分別與anti-miR-374b-5p或anti-miR-NC共轉染至SKOV3/Taxol細胞，經Taxol干預處理后，檢測細胞的增殖和凋亡情況。

1.2.2細胞藥物處理 將對數期SKOV3和SKOV3/Taxol細胞分別接種至96孔板，當細胞貼壁后每孔分別加入不同濃度Taxol(20、40、80、160、320 ng/ml)干預處理48 h，隨后采用CCK-8法測定細胞增殖抑制率。

1.2.3實驗分組 分組：Taxol+si-NC組、Taxol+si-BLACAT1組、Taxol+miR-NC組、Taxol+miR-374b-5p組、Taxol+si-BLACAT1+anti-miR-NC組和Taxol+si-BLACAT1+ anti-miR-374b-5p組。以上各組在轉染后，均采用40 ng/ml Taxol干預處理48 h。

1.2.4實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測BLACAT1和miR-374b-5p的表達水平 收集臨床樣本、SKOV3細胞及各組SKOV3/Taxol細胞，采用Trizol一步法分別提取組織和各組細胞的總RNA，隨后進行反轉錄制備cDNA，然后以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測。反應體系(20 μl)：cDNA為2 μl，上游引物(10 μmol/L)0.5 μl，下游引物(10 μmol/L)0.5 μl，SYBR Green Mix 10 μl，RNase-Free水7 μl。引物序列為：BLACAT1上游引物5′-CCTGCTTGGAAACTAATGACC-3′，下游5′-AGGCTCAACTTCCCAGACTCA-3′；miR-374b-5p上游引物5′-TCAGCGGATATAATACAACCTGC-3′，下游5′-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC-3′;U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAG-ATT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。采用2-ΔΔCt法計算BLACAT1和miR-374b-5p的相對表達量。

1.2.5CCK-8法檢測細胞增殖活力 取對數生長期的細胞接種于96孔板，當細胞融合度為60%時按照1.2.3分組進行轉染，48 h后每孔加入Taxol濃度為40 ng/ml的培養液100 μl，培養48 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μl，繼續培養4 h在酶標儀測定450 nm波長處吸光度(OD)值，計算細胞增殖抑制率。抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化各組SKOV3/Taxol細胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，離心后，用結合緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為1×106個/ml。取100 μl細胞懸液加入到流式管內，隨后加入5 μl的Annexin V-FITC，混勻后，室溫避光孵育10 min，再加入10 μl PI溶液，繼續孵育5 min，補加PBS至500 μl，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.7Western印跡檢測增殖、凋亡相關蛋白表達水平 采用RIPA細胞裂解液提取各組細胞蛋白后，按照BCA試劑盒測定蛋白濃度。取適量細胞蛋白和上樣緩沖液混合后，沸水浴5 min變性細胞蛋白。按照每孔30 μg變性蛋白樣品進行上樣，隨后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析細胞蛋白。電泳完畢后，利用濕法轉膜裝置將蛋白轉至PVDF膜，隨后將膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，吸盡封閉液，洗膜緩沖液漂洗3 min，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜，洗膜液漂洗5 min，漂洗3次后，加入相應的Ⅱ抗室溫孵育1 h，洗膜液再次漂洗3次后，采用電化學發光(ECL)試劑進行顯色，拍照后，采用Image J軟件分析目的條帶灰度值。

1.2.8雙熒光素酶報告基因實驗 采用StarBase在線預測顯示，BLACAT1的3′UTR含有與miR-374b-5p互補的核苷酸序列，猜測miR-374b-5p是BLACAT1的靶基因，隨后采用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證。利用LipofectamineTM2000將含有BLACAT1的3′UTR的WT熒光素酶報告基因載體WT-BLACAT1和MUT熒光素酶報告基因載體MUT-BLACAT1分別與miR-374b-5p mimics和miR-NC共轉染至SKOV3/Taxol細胞，轉染48 h后分別收集各組細胞，按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書測定熒光素酶活性。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1lncRNA BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌組織中的表達 與癌旁組織比較，卵巢癌組織中BLACAT1表達水平顯著升高，miR-374b-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌組織中的表達

2.2lncRNA BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌細胞和卵巢癌Taxol耐藥細胞中的表達 與卵巢癌細胞SKOV3比較，卵巢癌Taxol耐藥細胞SKOV3/Taxol中BLACAT1表達水平顯著升高，miR-374b-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌細胞和卵巢癌紫杉醇耐藥細胞中的表達

2.3Taxol對卵巢癌細胞和卵巢癌Taxol耐藥細胞的抑制作用 SKOV3細胞和SKOV3/Taxol細胞中，隨著Taxol劑量增高，細胞抑制率均顯著升高，且同一劑量Taxol，SKOV3/Taxol細胞抑制率顯著低于SKOV3細胞(P<0.05)；SKOV3/Taxol細胞IC50(631.21±41.21)顯著低于SKOV3細胞(109.90±9.11，P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度Taxol對卵巢癌細胞和卵巢癌Taxol耐藥細胞抑制率的影響

2.4沉默BLACAT1聯合Taxol(40 ng/ml)對SKOV3/Taxol細胞增殖和凋亡的影響 與Taxol+si-NC組比較，Taxol+si-BLACAT1組SKOV3/Taxol細胞BLACAT1、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，miR-374b-5p、p21、Bax蛋白水平、細胞增殖抑制率和凋亡率均顯著增加(均P<0.05)。見圖1、表4。

2.5過表達miR-374b-5p聯合Taxol對SKOV3/Taxol細胞增殖和凋亡的影響 與Taxol+miR-NC組比較，Taxol+miR-374b-5p組SKOV3/Taxol細胞CyclinD1和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，miR-374b-5p、p21和Bax蛋白水平、細胞增殖抑制率和凋亡率均顯著增加(均P<0.05)。見表5、圖2。

2.6lncRNA BLACAT1靶向調控miR-374b-5p的表達 利用StarBase在線預測顯示，BLACAT1的3′UTR含有與miR-374b-5p互補的核苷酸序列，見圖3。與miR-NC和WT-BLACAT1共轉染組比較，miR-374b-5p mimics和WT-BLACAT1共轉染組SKOV3/Taxol細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-BLACAT1共轉染組比較，miR-374b-5p mimics和MUT-BLACAT1共轉染組SKOV3/Taxol細胞的熒光素酶活性無統計學意義(P>0.05)。見表6。與pcDNA組SKOV3/Taxol細胞miR-374b-5p表達水平(1.00±0.09)比較，pcDNA-BLACAT1組(0.42±0.04)顯著降低(P<0.05)；與si-NC組SKOV3/Taxol細胞miR-374b-5p表達水平(0.99±0.08)比較，si-BLACAT1組(2.24±0.23)顯著升高(P<0.05)。提示miR-374b-5p是BLACAT1的靶基因，BLACAT1負性調控miR-374b-5p表達。

表6 雙熒光素酶報告實驗

2.7干擾miR-374b-5p表達逆轉沉默BLACAT1對SKOV3/Taxol細胞耐藥性 與Taxol+si-BLACAT1+anti-miR-NC組比較，Taxol+si-BLACAT1+anti-miR-374b-5p組SKOV3/Taxol細胞CyclinD1和Bcl-2水平、miR-374b-5p、p21和Bax水平、細胞增殖抑制率和凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖4、表7。

3 討 論

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，獲得性耐藥是導致卵巢癌患者死亡的主要原因〔10〕。Taxol作為治療卵巢癌的一線化療藥物，其和順鉑聯合使用初期效果較好。然而，大多數患者在治療1～2年后會出現化療耐藥和復發，其中位無進展生存期僅為12～16個月，5年存活率僅為27%〔11〕。lncRNAs是一種非蛋白編碼轉錄本，其在卵巢癌的發生、轉移和預后中發揮調控作用〔12〕。研究表明lncRNA表達失調與卵巢癌細胞Taxol耐藥有關。例如，lncRNA KB-1471A8.2在卵巢癌組織和耐藥卵巢癌細胞中均顯著下調，過表達KB-1471A8.2可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移和Taxol耐藥，誘導卵巢癌細胞的凋亡〔11〕；然而，LINC01118在卵巢癌組織和耐藥細胞中呈高表達，LINC01118可抑制卵巢癌細胞凋亡，促進細胞遷移、侵襲和Taxol耐藥〔13〕。本研究結果提示BLACAT1的表達上調可能與卵巢癌細胞的Taxol耐藥有關。隨后構建沉默BLACAT1的SKOV3/Taxol細胞株，發現沉默BLACAT1可抑制SKOV3/Taxol細胞增殖，促進Taxol誘導的細胞凋亡，提高卵巢癌細胞對Taxol的敏感性。

miR-374b-5p的表達失調與人類多種疾病相關，包括腫瘤。研究發現miR-374b-5p在乳腺癌中表達上調〔14〕；然而miR-374b-5p在膀胱癌中表達下調發揮抑癌基因作用〔15〕。此外，miR-374b-5p和胰腺癌細胞的吉西他濱耐藥相關，其胰腺癌耐藥細胞中的表達低于藥物敏感性的細胞，過表達miR-374b-5p可改善胰腺癌細胞對吉西他濱藥物的耐藥性〔16〕。本研究結果提示，沉默BLACAT1通過上調miR-374b-5p可提高卵巢癌細胞對Taxol的敏感性。在后續研究中，將開展體內實驗進一步驗證BLACAT1/miR-374b-5p軸在卵巢癌細胞Taxol耐藥中的作用。

綜上，lncRNA BLACAT1在卵巢癌組織和Taxol耐藥卵巢癌細胞中呈高表達，而miR-374b-5p呈低表達，沉默BLACAT1通過上調miR-374b-5p可抑制卵巢癌細胞增殖，促進Taxol誘導的細胞凋亡，提高卵巢癌細胞對Taxol的敏感性。BLACAT1/miR-374b-5p軸有望成為Taxol耐藥卵巢癌的分子治療靶點。