水蛭素抑制RhoA/Rho激酶信號通路對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥反應和纖維化的影響

秦玉春，鄺向東，蔡林再，謝景臣

作者單位：海南西部中心醫院呼吸與危重癥醫學科，海南 儋州 571700

慢性阻塞性肺疾病（COPD）屬于常見的肺部疾病，其發病機制主要是氣道炎癥、氣流受限，而有害氣體、吸煙、揚塵以及病原微生物等成為造成COPD的主要原因［1］。該疾病的發病率呈現逐年增長的趨勢，已成為全球第三大死亡的主要原因，給病人及家庭造成嚴重的經濟負擔［2］。研究報道，西藥對于COPD的治療雖然具有一定的作用，但其副作用嚴重限制了該類藥物的廣泛使用，因此副作用小，藥效穩定的中草藥逐漸成為治療COPD的研究熱點［3］。水蛭素是螞蟥的主要活性成分，是目前發現的最高效的天然凝血酶抑制劑，臨床上被廣泛應用于治療冠心病、肝硬化以及腦血栓等疾病，研究表明水蛭素還具有凝血、抗炎、抗纖維化等作用，但對于COPD的治療目前鮮有報道［4］。RhoA/Rho激酶（Rho kinase，ROCK）信號通路是重要的信號轉導系統，在細胞遷移、發育、生長、分化等過程中發揮重要作用，也是神經突生長、骨形成、背側閉合和肌生成所必需的，該途徑的失調與不同類型的疾病有關，包括與肺部相關的疾病［5］。于2020年1—6月，本研究通過氣管內滴注脂多糖（LPS）溶液建立COPD模型，經水蛭素干預后，探索水蛭素對COPD大鼠炎癥反應和纖維化以及RhoA/ROCK信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 北京維通利華實驗動物技術有限公司提供52只8周齡、雄性、清潔級SD大鼠，體質量范圍220~250 g，動物生產許可證號為SCXK（京）2016-0011，動物質量合格證號為1100111911008834。所有大鼠分籠飼養于溫度范圍22~25℃、濕度范圍50%~60%、12 h光照/黑暗循環的飼養房中，常規喂養一周后開始實驗。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 實驗試劑與儀器 水蛭素（BTN130542，20 000 ATU/mL）購自北京百奧萊博科技有限公司；HE染色試劑盒（MM1013）購自上海懋康生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測試盒（EKR38696）購自北京博沃爾斯生物科技有限公司；Masson三色膠原試劑盒（CSX10001）購自上海莼試生物科技有限公司；白細胞介素-1β（IL-1β）（H002）購自南京建成生物工程研究所；RhoA一抗（ab187027）、Rho激酶1（ROCK1）一抗（ab134181）購自abcam公司；ROCK激活劑［溶血磷脂酸（LPA）］（L7260，1 mg）購自Sigma公司。

MK3酶標儀購自芬蘭雷勃公司；IX71熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；動物肺功能分析儀購自北京拜安吉科技有限公司；Optima MAX-TL臺式超速離心機購自貝克曼庫爾特國際貿易（上海）有限公司；600D型通用型電泳儀電源購自北京鴻濤基業科技發展有限公司。

1.2 COPD大鼠模型的制備、分組及給藥參照文獻［6］復制COPD大鼠模型：將適應性喂養一周的52只大鼠，按照隨機數字表法選取10只作為對照組，剩余42只大鼠作為造模組，在實驗第1、15天時，對造模組大鼠采用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，于大鼠頸部中央消毒并切開切口，分離氣管，采用頭皮針穿刺氣管，然后向氣管內注入濃度為1 g/L LPS溶液（2 mg/kg）；注入結束后，為使藥物充分流入肺內，可將大鼠立起旋轉2 min，之后縫合傷口，上述操作均在無菌條件下完成。當大鼠0.3秒用力呼氣容積（FEV0.3）與用力肺活量（FVC）比值（FEV0.3/FVC）<70%時，表明大鼠模型建立成功［7］。造模過程中大鼠死亡2只，將造模組剩余40只大鼠按照隨機數字表法分為模型組、水蛭素組、LPA組、水蛭素+LPA組，10只/組。水蛭素組分別給予50 U/kg水蛭素灌胃 干預［8］，LPA組給 予 腹腔 注射40μg/kg LPA干預［9］；水蛭素+LPA組分別給予50 U/kg水蛭素、40 μg/kg LPA干預；其余各組給予生理鹽水干預，干預1次/天，連續干預4周。

1.3 觀察指標

1.3.1 肺功能檢測 次日，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定大鼠并對其頸部消毒，分離氣管，將氣管插管與肺功能分析儀連接，分別記錄FEV0.3、呼氣峰值流速（PEF）、FVC。

1.3.2 炎性因子指標的檢測 肺功能指標檢測完成后，麻醉大鼠，經頸部總動脈取血0.6 mL，4 000 r/min離心10 min，取上清，按照Elisa試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β水平。

1.3.3 觀察肺組織形態學及肺纖維化變化 取適量肺組織，脫水、透明并用石蠟包埋，制作切片，行HE、Masson染色，脫水、封片，觀察各組大鼠病理狀況及肺纖維化。

1.3.4 檢測大鼠肺組織中RhoA/ROCK通路蛋白表達 取適量肺組織，加入裂解液提取蛋白質，離心取上清，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，取適量蛋白上樣，電泳分離，轉膜，封閉；分別加入稀釋后（1∶1 000）的RhoA一抗、ROCK1一抗，4℃過夜孵育；洗膜后，加入二抗（1∶2 000）37℃孵育，ECL顯色曝光，以β-actin為內參，利用Image J圖像分析軟件分析條帶圖，得出目的蛋白的相對表達水平。

1.4 統計學方法本研究所得數據采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，均符合正態分布，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 水蛭素對各組大鼠肺功能指標的影響與對照組相比，模型組大鼠FEV0.3、FVC、PEF均顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，水蛭素組大鼠FEV0.3、FVC、PEF均 顯著增加（P<0.05），LPA組 大 鼠FEV0.3、FVC、PEF均顯著降低（P<0.05）；與LPA組相比，水蛭素+LPA組大鼠PEF、FEV0.3、FVC均顯著增加（P<0.05）；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組大鼠PEF、FEV0.3、FVC均顯著降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺功能指標的比較/±s

表1 各組大鼠肺功能指標的比較/±s

注：FVC為用力肺活量，PEF為呼氣峰值流速，FEV0.3為0.3秒用力呼氣容積。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與水蛭素組相比，P<0.05。④與LPA組相比，P<0.05。

組別對照組模型組水蛭素組LPA組水蛭素+LPA組F值P值鼠數10 10 10 10 10 FVC/（V/mL）11.21±1.12 7.41±0.71①10.98±0.99②5.34±0.53②8.83±0.85③④81.69<0.001 PEF/（mL/s）31.68±3.24 22.42±2.21①30.54±3.05②16.15±1.62②26.43±2.63③④58.93<0.001 FEV0.3/（V/mL）8.56±0.85 4.61±0.46①8.21±0.82②3.41±0.35②6.25±0.62③④117.84<0.001 FEV0.3/FVC/%76.12±0.76 62.11±0.59①74.77±0.75②63.85±0.61②70.78±0.71③④844.65<0.001

2.2 水蛭素對各組大鼠肺組織病理學變化的影響 對照組大鼠肺細胞形態正常，結構正常；模型組與對照組相比，大鼠細胞出現炎性浸潤，上皮細胞出現脫落，管壁增厚；與模型組相比，水蛭素組大鼠病理組織得到改善，炎性浸潤減少，細胞脫落、管壁增厚程度逐漸改善，LPA組大鼠炎性浸潤、細胞脫落以及管壁增厚程度均明顯增加；與LPA組相比，水蛭素+LPA組大鼠病理程度均得到緩解；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組大鼠炎性浸潤、細胞脫落等均增加。見圖1。

圖1 水蛭素對各組大鼠肺組織病理學的影響（蘇木精-伊紅染色×200）

2.3 水蛭素對各組大鼠肺纖維化的影響模型組大量細胞被染成藍色，極少量細胞質呈現紅色；與模型組相比，水蛭素組大量細胞質被染成紅色，著藍色細胞明顯減少，LPA組肺纖維化程度明顯加深；與LPA組相比，水蛭素+LPA組細胞著藍色明顯減少，紅色細胞質逐漸加深；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組細胞著藍色逐漸增加，紅色細胞質逐漸變淺。見圖2。

圖2 水蛭素對各組大鼠肺纖維化的影響（Masson染色×200）

2.4 水蛭素對各組大鼠炎性因子水平的影響模型組大鼠TNF-α、IL-1β水平較對照組均顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，水蛭素組大鼠TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P<0.05），LPA組大鼠TNF-α、IL-1β水平均顯著增加（P<0.05）；與LPA組相比，水蛭素+LPA組大鼠TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P<0.05）；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組大鼠TNFα、IL-1β水平均顯著增加（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠炎性因子指標的比較/（ng/L±s）

表2 各組大鼠炎性因子指標的比較/（ng/L±s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與水蛭素組相比，P<0.05。④與LPA組相比，P<0.05。

組別對照組模型組水蛭素組LPA組水蛭素+LPA組F值P值鼠數10 10 10 10 10 TNF-α 100.32±10.02 545.37±54.56①115.35±11.55②768.39±76.93②265.73±27.11③④427.46<0.001 IL-1β 65.78±6.66 158.63±15.89①68.72±6.88②278.63±27.91②100.48±10.05③④322.29<0.001

2.5 水蛭素對各組大鼠RhoA/ROCK通路蛋白表達的影響模型組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達較對照組均顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，水蛭素組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著降低（P<0.05），LPA組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著增加（P<0.05）；與LPA組相比，水蛭素+LPA組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著降低（P<0.05）；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著增加（P<0.05）。見圖3，表3。

圖3 各組大鼠肺組織RhoA、ROCK1蛋白質印跡法圖

表3 各組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達的比較/±s

表3 各組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達的比較/±s

注：RhoA為蛋白RhoA，ROCK1為Rho激酶1，β-actin為β-肌動蛋白。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與水蛭素組相比，P<0.05。④與LPA組相比，P<0.05。

組別對照組模型組水蛭素組LPA組水蛭素+LPA組F值P值鼠數10 10 10 10 10 RhoA/β-actin 0.22±0.02 0.78±0.07①0.27±0.03②1.02±0.11②0.58±0.06③④262.05<0.001 ROCK1/β-actin 0.25±0.02 0.74±0.07①0.29±0.03②0.98±0.09②0.57±0.06③④263.77<0.001

3 討論

COPD疾病已經影響全球十分之一的人口，被世界衛生組織確定為全球未被滿足的主要健康需求，且數據顯示，到2030年COPD將成為全球第三大致命疾病，預計將影響越來越多的全球人口［10-11］。COPD是一種使人衰弱但可預防的多因素疾病，其特征是無法治愈的進行性氣流受限，臨床表現多種多樣，包括肺氣腫、慢性支氣管炎以及病人的呼吸道癥狀急性惡化，給醫療系統和社會均帶來巨大的經濟負擔［12］。本研究通過氣管內滴注LPS溶液建立COPD模型，當FEV0.3/FVC<70%時，表明大鼠模型建立，可進一步研究。

COPD的發病機理較為復雜，而異常的炎癥反應被認為參與了COPD病情發展，因此炎性因子如TNF-α、IL-1β在COPD氣道炎癥反應中發揮關鍵作用［13］。水蛭素是一種從中藥水蛭中提取的分泌多肽，被認為是最有效的天然凝血酶抑制劑，含有抗癌、抗凝血、抑菌和降血脂等多種藥理活性，與許多疾病的病理過程有關［14］。Shen等［15］研究發現人錳超氧化物歧化酶與水蛭素的融合蛋白可以降低肺部炎癥，阻止肺纖維化的發展。水蛭素可抑制博萊霉素致特發性肺間質纖維化大鼠的肺組織炎癥和纖維化，且呈現劑量依賴性［16］。本研究發現模型組大鼠肺組織損傷及纖維化較嚴重，PEF、FEV0.3、FVC較對照組顯著降低，而IL-1β、TNF-α水平均顯著增加；經水蛭素干預后，大鼠肺組織損傷及纖維化程度得到改善，PEF、FEV0.3、FVC較模型組顯著增加，而IL-1β、TNF-α水平均顯著降低，表明水蛭素可以抑制COPD大鼠的炎癥反應和肺纖維化，改善肺損傷。

RhoA/ROCK信號通路參與多種器官纖維化、心腦血管以及腫瘤浸潤等疾病的發生。研究表明通過LPS構建的肺損傷模型中可導致大量炎癥細胞的產生，而LPS可激活RhoA/ROCK信號通路參與肺損傷的發展過程［17］。賈海燕等［18］研究發現烏司他丁可以通過抑制RhoA/ROCK信號通路，降低膿毒癥小鼠的肺水腫，改善血管通透性和肺損傷。陳勇等［19］研究發現抑制RhoA/ROCK信號通路可以降低炎癥反應，減輕病人機械通氣時的肺損傷。本實驗研究發現模型組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著增加；經水蛭素干預后，大鼠肺組織中RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著降低。表明水蛭素可以抑制RhoA、ROCK1蛋白表達，改善COPD大鼠肺損傷狀況。為進一步驗證該猜想，實驗引入ROCK的激活劑-LPA，結果發現LPA組大鼠較模型組大鼠肺組織損傷及纖維化程度進一步加重，PEF、FEV0.3、FVC較模型組顯著降低，而IL-1β、TNF-α、RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著增加；與水蛭素+LPA組相比，水蛭素組大鼠肺組織損傷及纖維化程度得到改善，PEF、FEV0.3、FVC較模型組顯著增加，而IL-1β、TNF-α、RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著降低。揭示了水蛭素可以抑制COPD大鼠的炎癥反應和肺纖維化，改善肺損傷，可能與抑制RhoA/ROCK信號通路有關。

綜上所述，水蛭素可以通過抑制RhoA/ROCK信號通路，抑制COPD大鼠的炎癥反應和肺纖維化，阻止COPD疾病的進一步發展，為臨床治療COPD疾病提供新的研究方向。