犬冠狀病毒的檢測與防治措施

張婷 蔣郁明 曾俊霞 侯月娥* 費奕強 薛曉陽

（1，珠海科藝普檢測科技有限公司 519000；2，廣東省珠海市動物疫病預防控制中心 519000；3，天津農學院水產學院 300000）

新冠疫情在全球爆發以來，對人類健康及公共衛生安全造成了嚴重的威脅。同時，也引起了人們對冠狀病毒的高度重視。冠狀病毒是一類大型的病毒家族。自然宿主范圍很廣可感染多種脊椎動物，如人類、犬、貓及家禽等，引發人類或動物嚴重的消化道、呼吸道及神經系統疾病[1]。犬冠狀病毒是冠狀病毒的一種，最早是由Binn 等在1971 年從腹瀉的德國軍犬中分離到，從此在全世界流行爆發[2]。犬冠狀病毒主要引起犬急性腸胃炎。臨床表現為頻發嘔吐、腹瀉最終出現嚴重的脫水或酸中毒，導致犬只死亡[3]。對犬養殖業造成了嚴重的威脅[4]。本文主要從犬冠狀病毒的病原特征、流行特點、發病機制、臨床癥狀、診斷方法及防治措施等對犬冠狀病毒進行綜述。以期為犬冠狀病毒引發的各種疾病的綜合防治提供理論參考。

1 病原

冠狀病毒屬于套式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬。可引起多種動物的急慢性疾病。2011 年，國際病毒分類委員會將冠狀病毒分為α、β、γ 和δ 4 個屬[5]。犬冠狀病毒、貓冠狀病毒與豬傳染性腸胃炎病毒同屬于α 屬冠狀病毒。犬冠狀病毒是一類具有囊膜結構的單鏈RNA 病毒[6]。該病毒成圓球形或橢圓形，直徑約為60～200nm，表面具有冠狀病毒特有的放射形突起，均勻分布于整個病毒的表面。犬冠狀病毒對熱、紫外線、脂溶劑、非離子去污劑、甲醛和氧化劑等一般的化學藥品均敏感，對酸穩定[7]。在-70℃狀態下可保存數年；4℃可保存數月仍具有感染性[8]。

2 流行病學

犬冠狀病最早是1971 年Binn 等在德國患病軍犬中首次成功分離。后來被用于廣泛的研究。我國初次發現犬冠狀病毒是在1985 年，由徐漢坤等首次報道有犬冠狀病毒的流行[9]，后來犬冠狀病毒感染警犬、軍犬、民用犬的事件被相繼報道。犬冠狀病毒的感染沒有物種特異性，不同品種、年齡的犬只均可被感染。同時，對犬科的狐貍及貉也具有感染性。但相對成年犬來說，幼犬更容易被感染。2016 年孫秋艷在山東地區進行寵物犬冠狀病毒病的流行病學調查中表明，一歲以內的幼犬檢出率為25.2%～72.4%；2 月齡～4 月齡犬的檢出率為72.4%；大于1歲犬冠狀病毒的檢出率低于13.4%[10]。犬冠狀病毒感染具有明顯的季節性。全國范圍的調查顯示，在春季、秋末及冬季溫度較低的季節犬只發病率更高。而在夏季由于犬冠狀病毒引起的疾病發生較少[11]。犬冠狀病毒主要以病犬和帶毒犬的糞便和污染水源為主要傳染源。可以通過攝食、飲水間接或直接傳染給易感犬只。感染率為100%，病死率為50%。所以要對患病犬及時進行隔離處理，并對犬舍進行全面的消毒處理。對病死犬要進行深埋處理，禁止解剖及食用。

3 發病機制

犬冠狀病毒主要以病犬和帶毒犬的糞便和污染水源為主要傳染源。經糞口途徑進入易感犬的體內，在感染后2d 到達十二指腸部分[12]。病毒表面的S 蛋白與宿主小腸內的細胞受體進行特異性結合，然后經過細胞膜的胞吞作用進入小腸絨毛間的吸收細胞內[13-14]。之后病毒利用宿主本身的復制系統幫助其自身進行復制增殖，在胞質空泡的平滑膜上出芽，造成細胞破裂[15]。犬冠狀病毒被重新釋放出來，加劇小腸部分的感染。最終造成小腸絨毛變粗變短，消化酶分泌停止，消化吸收能力大大降低。造成犬只腹瀉[16]。如不及時對患病犬消炎補液，最終會導致機體嚴重脫水或酸中毒而死。一般情況下，只有犬冠狀病毒感染致死力較弱。但犬冠狀病毒會嚴重損害犬體內的NK細胞和調節性T 細胞，大大降低宿主的免疫力[17]。當與輪狀病毒、犬細小病毒混合感染或遭遇氣溫驟變、運輸、應激情況時易對犬只造成致命性的威脅。

4 臨床癥狀

感染犬冠狀病毒的犬只臨床癥狀主要表現為精神不振、喜臥、嘔吐、腹瀉、血便，并伴隨強烈的腹痛。多數犬只體溫變化不大，感染前期嘔吐物主要為未消化的食物，后期嘔吐物為黃色泡沫樣及黏稠的液體。隨后出現嚴重的腹瀉癥狀。糞便呈糊狀或半糊狀甚至水樣，呈橙色或綠色，其中含有黏液或血液[18]。最終犬只出現脫水或酸中毒現象。臨床上幼犬的發病現象比成年犬嚴重。病程為7～10d，部分幼犬在發病1～2d 后死亡，成年犬在服用藥物一周內便可恢復，但在一個月內可能會有復發[19]。

5 診斷方法

犬冠狀病毒引起的感染與輪狀病毒感染出現的臨床癥狀相似，并且常與輪狀病毒、犬細小病毒混合感染，所以準確的鑒定犬冠狀病毒需要做進一步的實驗室檢測。目前實驗室檢測犬冠狀病毒的方法主要有病毒分離培養、電鏡觀察及血清學診斷技術、普通RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR、納米PCR 等。

5.1 病毒分離培養

對患病犬的糞便進行取樣，在無菌條件下進行離心，取上清液于0.22um 的過濾器中進行過濾。然后將犬冠狀病毒接種于犬腎臟細胞的細胞培養液中，于37℃、5% CO2條件下在恒溫培養箱內培養2d[20]。接種了犬冠狀病毒的細胞表現出細胞變圓、脫落沒有明顯的細胞輪廓的病變癥狀。該實驗方法具有直觀、簡便等優點。但該實驗方法與高通量篩選的方法相比靈敏度較差，耗費時間較長，人為因素較多，容易造成較大的結果誤差。

5.2 電鏡觀察

由于犬冠狀病毒具有獨特的外形特征，所以可以使用電鏡對其進行鑒定，觀察病毒周圍“冠”的有無[21]。但該實驗方法的實驗誤差較大，使用費用昂貴等一系列缺點限制其使用，且容易出現假陰性結果。因為冠狀病毒易變異，變異毒株會出現冠脫落或冠不明顯等一系列特點。

5.3 血清學診斷技術

臨床診斷上檢測疾病較為常用的方法是血清學診斷。血清學診斷主要包括中和實驗及間接ELISA 方法。熊煒等[22]通過構建重組質粒對犬冠狀病毒蛋白編碼基因進行克隆、表達，之后對蛋白進行純化，建立了犬冠狀病毒間接ELISA 的方法。中和實驗是由Binn 等[23]首先創立的，對患病犬的血清進行采集然后進行實驗鑒定。該實驗方法具有極高的特異性，甚至優于ELISA 法。

5.4 普通RT-PCR

與以上實驗方法相比，普通RT-PCR 具有特異性強、靈敏度高等一系列優點。普通RT-PCR 可以對輕微患病犬進行病原檢測[24]。但該實驗方法不能定量檢測犬冠狀病毒的載量。且在其實驗過程中易出現假陽性及非特異性擴增等問題。

5.5 實時熒光定量RT-PCR

實時熒光定量RT-PCR 作為近年來發展起來的一種可用于病原體檢測的技術，具有特異性強、敏感性高等優點，能在較短時間內完成病原體檢測，被廣泛應用于動物疾病檢測、臨床診斷等領域[25]。在犬冠狀病毒特異性檢測中，熒光定量RT-PCR 比普通RT-PCR 的靈敏度高10 倍。且同時具有準確率高、檢測速度較快、重復性好等一系列的優點。但該實驗操作需要精密的儀器及熟練的操作人員，不適用于臨床上的廣泛研究。

5.6 納米PCR

納米PCR 主要是在普通PCR 基礎上，在PCR 反應體系中加入納米金顆粒。納米金顆粒具有較高的表面活性，可以與酶分子進行特異性結合并保持穩定。同時，由于納米金顆粒具有較小的尺寸，可以調節聚合酶與DNA 之間的特異性結合，間接的調整聚合酶濃度，有助于引物與模板結合，提高目的基因片段的擴增效率。與此同時，納米金顆粒良好的熱傳導性能有助于縮短變性時間，提高反應靈敏度[26]。在退火時，抑制非特異性片段的合成，提高PCR 的保真度。由于納米PCR 操作簡單，成本上低于熒光定量PCR，因此，納米PCR 更適用于臨床疾病的快速診斷。

6 防治措施

現在犬冠狀病毒的治療沒有特效藥，多采取“預防為主，加強管理的原則”。預防措施主要為每天打掃犬舍，保持犬舍清潔。對帶毒母犬的產房及乳房要進行嚴格的消毒處理。同時，給健康犬只注射犬免疫球蛋白和犬冠狀病毒高免血清，增強犬的免疫力。由于犬冠狀病毒具有垂直傳播的特點，所以可以對妊娠母犬注射疫苗，激發母犬體內的機體免疫，幼犬通過乳汁獲得抗體，增強幼犬免疫力。

如發現患病犬，首先應對患病犬只進行及時的隔離處理。并對病犬的排泄物、犬舍及接觸物進行消毒，切斷病原傳播途徑。針對患病犬只主要采取糾正機體脫水、防止酸中毒、抑制嘔吐、抗病毒為主的治療原則。因該病主要引起犬只嚴重腹瀉，造成犬只脫水，所以應對患病犬及時補充葡萄糖、電解質、鉀離子及三磷酸腺苷糾正犬體內的酸堿及電解質失衡。同時，為了避免病犬混合感染犬細小病毒、輪狀病毒可以采取干擾素、球蛋白相配合的治療方法。犬在患病后，胃腸功能減弱或紊亂，盲目飼喂只能增加腸胃負擔，導致病情進一步加重。所以，在病犬不再嘔吐后可以投喂一些容易消化的食物[27]。嚴禁解剖和食用病死犬，應進行深埋處理。然后用生石灰、1:30漂白粉溶液、0.2%～1%甲醛溶液等有效消毒劑徹底消毒飼養場地和圈舍，避免健康犬接觸病死犬污染物。

7 展望

犬冠狀病毒在我國家犬、軍犬及流浪犬之間普遍存在。該類病毒在復制過程中極易發生突變，治病能力也在逐漸增強。犬冠狀病毒主要引起犬只嘔吐、腹瀉導致犬只脫水或酸中毒。但目前對該病毒的認識及重視程度遠遠不夠。在2019 年由SARS-COV-2 引起的新冠疫情對世界各國人們的生命健康及經濟發展造成了巨大的影響，也引起了人們對冠狀病毒的高度重視。基因組同源性結果分析顯示，SARS-COV-2 于犬冠狀病毒的同源52.6%～53.0% 。雖然犬冠狀病毒與SARS-COV-2較低，但也應引起人們的重視，以探索冠狀病毒的起源及對不同宿主的致病性。未來還應進一步完善全國各地的犬冠狀病毒流行范圍，為研發更加高效的診斷技術及疫苗提供參考依據。