非洲豬瘟實驗室審核中存在的問題探討

莫靜華 黎劍威 黃玉淑 何鳳愿 韋成威

（廣西河池市動物疫病預(yù)防控制中心 547000）

非洲豬瘟在中國爆發(fā)以來，豬只減產(chǎn)到現(xiàn)在開始復(fù)養(yǎng)經(jīng)歷了幾年的時間，國家出臺了許多相關(guān)對策。許多相應(yīng)機制得以建立與完善，其中許多縣級獸醫(yī)實驗室和第三方屠宰企業(yè)實驗室在經(jīng)過權(quán)威實驗室比對實驗后也得到授權(quán)，允許開展非洲豬瘟實驗室檢測并出具有效非瘟檢驗報告；受上級部門委托，筆者有幸參加本市范圍內(nèi)獸醫(yī)實驗室非洲豬瘟自檢考核工作；近幾年來，筆者曾考核過多個縣區(qū)級動物預(yù)防控制中心、養(yǎng)殖企業(yè)、屠宰企業(yè)等獸醫(yī)實驗室，筆者發(fā)現(xiàn)，這些獸醫(yī)實驗室普遍存在一些問題，在此，筆者分別從5個方面進行探討，對出現(xiàn)的問題給出自己的意見與見解。在這里進行總結(jié)，供相關(guān)人員參考。

1 實驗人員存在問題

這部分主要為屠宰企業(yè)與第三方機構(gòu)的實驗室人員資質(zhì)問題，這些實驗人員大多是企業(yè)老板臨時從自己員工中抽調(diào)而來，是一些沒有相關(guān)獸醫(yī)知識基礎(chǔ)，也未經(jīng)專門培訓就直接上崗的屠宰工人。所謂的培訓，只是企業(yè)在購置PCR儀器時由廠家進行的一次儀器使用培訓，此后就直接應(yīng)急上崗進行實地作業(yè)，可謂一邊學習，一邊干活。鑒于此，本市動物疫病預(yù)防控制中心實驗室人員多次開展非洲豬瘟理論與實驗室檢測技術(shù)培訓。上級相關(guān)部門委托本市動物疫病預(yù)防控制中心對本范圍轄區(qū)內(nèi)的第三方獸醫(yī)實驗室與屠宰企業(yè)進行非洲豬瘟比對實驗，對于比對結(jié)果正確率達不到100%的企業(yè)進行通報，不予其正常營業(yè)活動，直至考核100%正確。筆者在抽樣過程中，檢查PCR儀的實驗記錄時發(fā)現(xiàn)，對于實驗中出現(xiàn)的明顯陽性樣品，實驗人員竟然無法判斷其陰陽性，記錄表格仍以陰性結(jié)果出具報告。

建議：對于資質(zhì)問題，筆者更傾向于企業(yè)中有相關(guān)專業(yè)學歷為首推人選，但絕非一定，對于好思勤學的人也可勝任這個崗位，經(jīng)過多次培訓與實操，是完全可以熟練掌握這項檢測技術(shù)，畢竟現(xiàn)在許多商家的試劑都為免抽提，大大降低了技術(shù)門檻，而熟練的工作人員可以大大降低人為帶來的污染，培訓顯得尤為重要。盡管培訓很多次，但仍存在一些人員不知如何判別陰陽性，這些人員中甚至包括官方獸醫(yī)人員。

2 儀器問題

部分存在的問題主要是儀器設(shè)備消毒問題；在PCR儀器中，未定期進行清理與消毒PCR加熱孔，尤其是屠宰企業(yè)幾乎天天殺豬，有些抗凝血血跡甚至飛濺入PCR加熱孔中，有些孔底布滿灰塵。使用完的槍頭隨意丟棄，沒有打入帶有消毒藥水的廢棄缸中，很容易造成污染。第二個普遍問題是紫外燈，在檢查時發(fā)現(xiàn)，一些實驗室的紫外線燈無法正常工作，有的處于無電狀態(tài)，紫外燈只是擺設(shè)與應(yīng)付檢查之用；再就是有些紫外燈懸掛較高，甚至釘在屋頂，這樣紫外燈的滅菌消毒效果大打折扣，還有些實驗室甚至沒有紫外燈，無消毒意識。

建議：第一，所用槍頭應(yīng)購置帶有濾芯的，這樣可以大大降低樣品間的污染，使用后的槍頭要打入廢棄缸中，缸中要泡有含氯消毒液。第二，定期使用75%酒精和含氯消毒液對PCR儀器、移液器等重要儀器設(shè)備進行擦洗消毒，并保持儀器周邊的衛(wèi)生，維護保養(yǎng)PCR儀。第三，紫外線燈管應(yīng)保持與桌子、地面最多1.5m范圍的高度，建議實驗結(jié)束后立即打開照射30min，并開窗通風。

3 設(shè)備、樣品等問題

在檢查過程中一個比較常見的問題是試劑盒與樣品共用一個冰箱或一個冰柜，留存的大批樣品可能會污染檢測試劑。還有一些企業(yè)甚至使用過期的試劑盒進行實驗。每次實驗的試劑用量并不大，每次只做幾頭份，試劑經(jīng)常從冰箱中取出，做完實驗又放回冰箱冷凍，如此反復(fù)凍融，在3～5次后試劑會開始失效。

建議：第一，購置兩臺冰柜或冰箱，一臺專門存放試劑，一臺專門存放待檢樣品與留存樣品。第二，使用的試劑盒推薦再第一次使用時要分裝出多管保存，這樣可以避免多次反復(fù)凍融對試劑所造成的影響。

4 方法存在問題

當前推薦的方法都是使用熒光PCR的方法檢測非洲豬瘟。筆者在檢查過程中沒有發(fā)現(xiàn)還有企業(yè)使用膠體金試紙條的情況。試劑盒抽提與免提取問題，筆者看過免抽提的步驟非常簡單，甚至有些商家代理吹噓使用抗凝血離心即可上PCR，無需抽提或裂解，在這里不推薦的，作為一個重要的檢測，不應(yīng)如此簡化，這樣得到的結(jié)果才令人信服。另一個是混樣問題，非洲豬瘟剛開始爆發(fā)時，有文件規(guī)定混檢比例為50：1，而現(xiàn)在已更正為20：1；筆者認為，在多個樣品混檢又不進行抽提的情況下，得出的最終結(jié)果不準確。假陰性偏多。另一個問題是由于選擇的采血管抗凝劑不同也會影響后續(xù)PCR實驗，一些抗凝管含有肝素，環(huán)境中的消毒劑也是PCR抑制劑，如果不進行抽提可能呈現(xiàn)假陰性情況。

建議：第一，有條件的獸醫(yī)實驗室建議使用抽提方法。第二，對于養(yǎng)殖企業(yè)的復(fù)養(yǎng)，要降低混檢比例，同時進行抽提步驟，可以反映出真實的情況，對后期復(fù)養(yǎng)防疫是很重要的參考指標。

5 實驗室存在問題

實驗室衛(wèi)生問題，實驗室內(nèi)雜物亂放，尤其是屠宰企業(yè)的化驗室條件簡陋，一臺PCR儀器與許多物品放在一張桌子上的問題非常多。另一個問題是實驗廢棄物處理問題，做完實驗后，擴增的PCR管隨意處理，使用后的一次性槍頭等廢棄物隨手亂扔，沒有進行專門的消毒處理。

建議：第一，進行PCR實驗環(huán)境非常重要，分子生物學實驗室一般都會分為3～4個區(qū)域，這樣做的目的就是避免各種污染，保證結(jié)果的正確，但屠宰場內(nèi)環(huán)境惡劣，進行PCR實驗的各種操作沒有任何密閉。筆者在培訓時告知大家如果可能，把一個房間分隔開來，即便沒有這樣的條件，至少在一張桌子上也應(yīng)拿一塊擋板把PCR儀與其他物品隔離開來，使PCR儀器至少有一個相對隔離的區(qū)域，這樣被相互污染的情況也會降低。第二，搞好環(huán)境衛(wèi)生，經(jīng)常開窗通風換氣，可有效降低氣溶膠產(chǎn)生的污染。

6 結(jié)語

各獸醫(yī)實驗室條件不同，存在的問題也不相同，以上只是筆者遇見的較為普遍的問題。除了上述的這5個方面，一個非洲豬瘟檢測實驗結(jié)果是否可靠、可信是多方面因素共同作用的結(jié)果，大到實驗室的各種規(guī)章制度，小到實驗中一個不起眼的不規(guī)范操作也許都是實驗成敗的關(guān)鍵。