分子靶向探針在血栓診斷中的應用

汪楷淳，劉楚軒，鄭元元

首都醫科大學1基礎醫學院，3藥學院，北京 100069；2北京航空航天大學生物與醫學工程學院，北京100083

血栓作為急性心肌梗死、缺血性腦卒中、肺栓塞等致死性疾病的發病原因，在世界范圍造成了大量的死亡以及不可逆的器官和組織功能損傷［1-2］。其中急性心肌梗死和缺血性腦卒中是構成50歲以上人群死亡和傷殘最高的兩種因素，每年在全球范圍造成了超過1240余萬人死亡，占總死亡數的20%以上［3］。我國每年心血管疾病引起的死亡約占總死亡人數的40%，其中多數與血栓相關［4］。因此，實現早期對血栓的精準診斷有著十分重要的臨床意義。

血栓的形成一般起自于血管壁的損傷［5］，內皮下基質暴露出膠原和組織因子。膠原能與循環中的血管性血友病因子結合，進而結合血小板上的GPIb/Ⅸ/V受體。在此過程中，伴隨著血小板的活化和血小板膜糖蛋白IIb/IIIa（GPⅡb/Ⅲa）的表達。GPⅡb/Ⅲa在血小板未激活時與纖維蛋白只有低親和性，而活化后能夠緊密結合纖維蛋白原，構成血小板間的連接，形成白色血栓。纖維蛋白原在凝血酶的激活下被轉化為纖維蛋白，并聚集為纖維蛋白多聚體，網羅血細胞，形成紅色血栓［6］。在凝血過程中，P-選擇素介導血小板、內皮細胞黏附以及白細胞的滾動，常在血栓前期大量表達［7-8］。GPⅡb/Ⅲa僅在活化的血小板表面大量表達［9］，纖維蛋白在凝血酶的刺激下才能轉化為纖維蛋白，血管性血友病因子也僅聚集于暴露出的內皮下基質。因此，GPⅡb/Ⅲa、纖維蛋白、血管性血友病因子以及P-選擇素等［9］都可以作為血栓分子成像的靶點。

分子影像技術于1999年被首次提出［10-11］。該技術將分子生物學與醫學影像學結合，使得影像診斷從解剖學層面精準到細胞和分子層面，并能定性和定量化的在早期診斷出病灶的位置和大小。分子影像技術可將基因表達和生物信號等微觀且復雜的過程以直觀的影像展現在人們面前，在分子細胞水平上即可充分地了解疾病的發生發展過程，有助于早期發現疾病的分子及病理改變，還可實現在活體上連續觀察藥物的效果。因此，分子影像技術可以推動疾病的早期診斷和治療。眾所周知，血栓性疾病常需要早期的診斷，錯過黃金診治期將會為患者的預后帶來極大的不利。因此，構建具有血栓高特異性的分子探針，靶向血栓位置，并通過影像技術以高分辨示蹤，將具有重要的研究意義和臨床價值［12］。本文將主要從核素成像（SPECT/PET）、MRI、光學成像、超聲成像以及多模態成像幾個方面對分子靶向探針在血栓診斷中的應用進行一詳細綜述。

1 單一模態分子靶向探針在血栓診斷中的應用

1.1 核素成像（SPECT/PET）分子靶向探針

盡管目前MRI、CT以及超聲都能夠檢測血栓，但只有核素成像可以進行全身性的血栓檢查。由于核素成像具備高靈敏性，且可反映組織代謝的情況，因此在診斷新鮮血栓和微小血栓方面有著其他技術無法比擬的優勢［13-14］。隨著SPECT/CT和PET/CT等技術的發展，核素成像逐漸成為臨床診斷血栓的一種重要方式。由于核素成像通常與CT一起使用，因此本文將PET/CT和SPECT/CT歸為單一模態成像。

GPIIb/IIIa作為血小板膜上粘合蛋白，是參與血小板的聚集主要因子。有實驗室構建了基于靶向活化的GPⅡb/Ⅲa的分子探針scFvantiLIBS-64CuMeCOSar，發現其能很大程度地增強PET對小鼠股動脈血栓的成像［15］。有學者在上述研究［15］的基礎上，構建類似的分子探針scFvanti-GPIIb/IIIa-MeCOSar。以心肌缺血再灌注小鼠為模型，通過尾靜脈注射分子靶向探針，在不同的心肌缺血和注射時間，獲得了與血小板聚集和心肌缺血程度正相關的PET成像，展現了該分子探針在診斷心肌梗死和血栓方向的前景［16］。有學者應用可以靶向結合纖維蛋白的多肽，合成了99mTc-標記的分子靶向探針。通過SPECT檢測小鼠頸動脈血栓時，發現其在血栓周圍的成像能力高于陰性對照組的多肽探針［17］。有研究構建了能特異結合纖維蛋白的線性HYNICGPRPP和環狀HYNIC-CGPRPPC兩種多肽，并分別與99mTc連接［18］。兩種分子靶向探針都具有靶向血栓的能力，其中環狀的99mTc-HYNIC-CGPRPPC多肽顯示出更強的結合能力，并在小鼠股動脈血栓模型中獲得了清晰的血栓成像。有學者通過將靶向纖維蛋白的探針與p-TU-Bn-DOTA以及64Cu結合，構建出基于PET技術的分子靶向探針64Cu-FBP2，在小鼠頸靜脈損傷模型中得到良好的血栓顯影［19］。后續研究在此基礎上，將p-TUBn-DOTA改為CB-TE2A，構建了64Cu-FBP7［20］。該探針在不影響靶向血栓的情況下，使血栓處和正常血液處的信號強度比例進一步增大。由于64Cu-FBP7合成時即便長時間加熱也難以達到足夠的純度，還需要HPLC提純等后續步驟，該試驗室［21］構建了可以省去提純步驟的64Cu-FBP12，雖然其顯像效果不如以上的兩種探針，但其反應的快捷性和純度是上述兩種探針難以比擬的。有學者利用64Cu、Al18F和兩種特異性靶向纖維蛋白的多肽組建了四種核素探針，其中的三種在增強血栓成像能力的同時，有著良好的生物相容性［22］。不同于其它核素探針，另一研究考慮到造價昂貴的問題，選取了一種造價較為低廉的P-選擇素—巖藻多糖［23］。他們用大鼠構建了腹主動脈瘤、感染性心內膜炎和心肌缺血再灌注3種模型，分別代表有生物活性的腔內血栓、血小板豐富的血栓和受損的心肌內皮。利用他們構建的分子探針99mTc-巖藻多糖，在3種模型中都獲得了良好的血栓SPECT成像。但該探針的空間定位性仍有待提升。不同于大部分目前仍處于動物實驗階段的分子探針，也有一些探針進入了人體實驗階段。在一項靈長類動物實驗［24］的基礎上，有研究分別招募了10名有急性動脈血栓特征或近期接受過動脈介入或手術的志愿者和20名有肺栓塞或深靜脈血栓的志愿者，測試了他們所合成的靶向GPIIb/IIIa受體的PET/CT探針18F-GP1，在靜脈血栓和動脈血栓兩個維度驗證了其安全性和有效性［25-26］。

雖然核素成像目前仍存在檢查費用高昂、分子探針的制備要求高和放射性等問題［13］，但以上研究展現了核素成像分子靶向探針在臨床診斷血栓的廣闊前景。在血栓診斷方面，核素成像因其檢測全身的可行性和相對于CT的低放射性［13-14］，有望在全身體檢和高危人群的定期檢查中發揮不可替代的作用。

1.2 MRI分子靶向探針

有學者構建了靶向GPIIb/IIIa 的核磁探針LIBS MPIOs。該探針具有較高的敏感度，可以定量地檢測血栓，并在頸動脈內膜剝脫術的病理標本上得到了其適用于人類的基本證據［27］。另有學者將靶向P-選擇素的配體與T1造影劑Gd-DOTA結合，構建出只與活化血小板結合的分子探針CM8FS［28］。雖然該實驗缺少核磁活體成像結果，但作為早期靶向血栓的核磁造影劑，推動了相關方向的發展。Caravan實驗室構建了靶向纖維蛋白的EP-2104R，該探針有著精準的靶向選擇性以及較高的弛豫率，并能夠實現人與多種動物的血栓成像［29］。在隨后的研究中，他們還發現二硫鍵是該探針能緊密性結合纖維蛋白的重要因素。EP-2104R可以在與活化血小板表面高度表達的蛋白質二硫鍵異構酶反應后發生空間結構的改變，從而能夠與纖維蛋白更加緊密地結合［30］。有學者構建了靶向P-選擇素的PsL-EGFmAb-BSA4-(Gd-DTPA)n，該順磁性分子靶向探針有著很高的弛豫率，并在狗的股靜脈血栓模型中得到了很好的血栓成像［31］。但由于P-選擇素只在早期血栓中大量表達［7］，從而降低了該分子靶向探針的普適性。有研究基于Fe3O4和聚乳酸-羥基乙酸（PLGA），在表面修飾靶向GPIIb/IIIa的環精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（cRGD），構建了Fe3O4-PLGA-cRGD NPs［32］。在大鼠腹主動脈血栓模型中得到良好成像，并通過血液學和病理學證明了其安全性和生物相容性。

1.3 超聲成像分子靶向探針

與其它成像技術相比，超聲成像具有成本低、無輻射和即時成像等優勢，在血栓性疾病診斷中有著長期的運用和重要地位。在臨床上，單純的超聲成像就能夠診斷大部分血栓性疾病。然而，隨著新型靶向造影劑的發展，超聲成像技術在診斷新鮮血栓、微小血栓和心臟血栓等方面也逐漸發揮作用［33］。值得一提的是，不同于其他靶向探針主要偏向于成像能力，超聲分子靶向探針常常能通過聲孔效應［34］以及微泡的載藥能力［35］進行溶栓，達到診療一體化的作用。

有學者利用可降解的聚異丁基氰基丙烯酸酯和巖藻多糖結合，構建一種全新超聲微泡探針［36］。其中可降解的聚異丁基氰基丙烯酸酯做為功能性微泡，不僅表面可以連接多種靶向糖蛋白，也可以在超聲信號下破裂，實現靶向給藥。同時，巖藻多糖有靶向P-選擇素的能力，在有剪切力情況下對活化的人血小板和小鼠血栓都有較好的靶向效果。該探針所具有的載藥能力使其在診療一體化方面展現更多可能。

2 多模態分子靶向探針在血栓診斷中的應用

在影像學與多學科交叉融合發展的趨勢下，出現了越來越多的集多種技術顯像能力為一體的分子靶向探針，即多模態分子靶向探針。相比于單一模態分子靶向探針，多模態分子靶向探針可以整合多種影像技術的優勢，例如集PET以及近紅外熒光的敏感度、CT和MRI的高空間分辨率、超聲探針微泡的載藥能力等于一身，發揮更大的成像潛能。

2.1 PET/MRI雙模態分子靶向探針

有學者將靶向纖維蛋白的EP-2104R探針中的Gd替換為64Cu，利用小鼠動脈血栓模型分別進行MRI和PET成像，發現在兩種技術下都能夠清晰地觀察到血栓。其中MRI成像顯示的血栓大小與實際大小相符，可以很準確地反映血栓的實際情況；而PET成像中血栓的大小略被夸大，但其有利于準確地發現血栓位置，各有其應用價值［37］。來自哈佛大學的研究者將靶向纖維蛋白的FBP8與核素64Cu結合，并在8位志愿者中進行了測試［38］。結果顯示該探針代謝穩定，并能以極高的準確度檢測急性和陳舊血栓。值得一提的是在其運用心臟核磁和PET的場景中，能夠診斷危險并難以檢測的左心耳血栓。

2.2 光學相關的雙模態分子靶向探針

光聲成像是一種合并了高對比度的光學成像和穿透性強的超聲成像，具有可定量分析和良好生物安全性的新興影像技術［39］，在血栓診斷中也可發揮作用［40］。

有實驗室構建了基于光聲成像和MRI技術的多種納米分子探針，其中無論紅血栓或白血栓，探針DDNP都有較佳的顯像效果。實驗中該課題組還發現，在注射探針后，MRI成像下發現血栓面積有明顯的減小（30%的縮減比例），提示其還擁有一定的治療作用［41］。有學者設計并合成了一種可以通過核磁、光學雙模態成像的探針，通過可逆加成-斷裂鏈轉移聚合鏈接雙環壬炔與二溴馬來酰亞胺，再通過疊氮化物連接和無銅的點擊反應，實現了伴隨DBM偶聯誘導的熒光［42］。共聚物中的二磷酸螯合了NaGdF4提供核磁能力，并和乙二醇共同提高了探針的穩定性與生物相容性。作者隨后將scFv單抗與該納米探針偶聯，實現特異靶向活化的GPIIb/IIIa受體。體外實驗驗證了該探針具有良好的生物相容性、發光效果和靶向效率。

不同于一般血栓，微血栓造成微血管缺血，是無再灌注現象、心臟X綜合征和血栓性微血管病的重要發病原因［43］。但目前大部分的對于血栓的檢測手段都難以檢測微循環中的血栓。針對這個問題，有學者將CREAK肽與超順磁性氧化鐵納米粒和熒光基團結合，在大鼠心肌缺血再灌注模型中實現了多模態成像，即該納米探針選擇性地積聚在微血栓內，在核磁共振和熒光成像中均有良好顯像［44］。

與CT、MRI等成像模式只能夠提供晚期血栓的延遲間接顯影相比，近紅外熒光成像因其可提供實時直接和間接的血栓造影而在血栓的診斷中逐漸受到青睞［45］。有研究將近紅外染料cy5.5與凝血酶激活肽（TAP）結合，使其能被凝血酶特異性剪切并發出熒光［46］。之后，進一步連接有著高X射線吸收系數的SiO4包埋的納米金顆粒，得到TAP-SiO2@AuNPs。其中新鮮制備TAP在水溶液中會有一定的熒光猝滅，但當其結合凝血酶時，熒光強度提高了30.31倍，顯示出巨大的差異性。另一方面，由于該納米探針的尺寸大小適宜（39.8 nm），易于被纖維蛋白和紅細胞的網狀結構捕獲并在血栓中累積，從而發揮納米金顆粒的CT成像能力。在小鼠血栓模型中，該探針在近紅外熒光和Micro-CT中均可獲得清晰成像。該探針的價值在于，在急性血栓及血栓前期，近紅外熒光成像可以高效檢測到此時的凝血酶聚集。而在血栓后期，密集的網狀結構可以捕獲并累積該探針，從而實現對于血栓整個階段的成像。美中不足的是，該探針只是利用尺寸而實現非特異性的血栓處聚集，其特異性還有待提高，另外也有進一步堵塞血栓或加劇血管狹窄的可能性。有學者將環狀的精氨酸-甘氨酸-cRGD與PLGA表面結合以靶向血栓，通過進一步將吲哚菁綠（ICG）包埋于納米探針中構建了具有雙模態成像（光聲和近紅外熒光）和溶栓作用的PLGA-cRGDPFH-ICG NPs 探針［47］。其中cRDG 可以靶向GPIIb/IIIa，實現該探針的靶向性；ICG則提供了光聲成像和近紅外熒光成像的能力，并具有良好的空間分辨率和高靈敏度。與大多數分子靶向探針不同的是，該探針在PLGA 中包埋了在超聲信號下能夠相變的全氟乙烷（PFH）。超聲作用下滲入到血栓內部的液相PFH可以迅速氣化，體積增大。在提高超聲信號強度的同時，PFH相變所產生的聲穿孔和空化效應可以破壞周圍的血栓，從而達到診療一體化的作用。也有研究利用相似的原理，加入了PLGA包埋的PFH［48］。不同的是，該課題組利用CREAK靶向肽靶向纖維蛋白，并通過引入Fe3O4得到光聲成像的能力。

熒光斷層掃描技術（FMT）具有組織穿透性強、背景熒光干擾低、熒光信號敏感度高、體內安全性良好等優勢，是一種有望在血栓診斷中發揮作用的新技術［49］。Jaffer實驗室利用靶向纖維蛋白的EP-2104R構建了能夠在FMT-CT中靈敏檢測血栓的FTP11-Cy7，在小鼠深靜脈血栓模型得到了三維的血栓圖像［50］。

3 總結與展望

能夠診斷血栓的分子靶向探針在多學科技術的推動下已經獲得了階段性的成功，尤其伴隨著近年來微納米技術的蓬勃發展，分子靶向探針具有廣闊的研究與應用前景。然而，目前大部分靶向探針依然存在著制備成本高，只停留在動物實驗階段，靶向效率、體內穩定性及生物安全性仍有待提高等方面的限制。特別是納米探針屬于相對新興的材料學科，人們對其毒性的了解還未研究透徹，且大多數納米探針的制備相對復雜，是否能夠實現工業化的大規模生產也是急需解決的問題之一。但值得欣喜的是，隨著近十年來分子探針技術的不斷發展，已然可以從已有的研究中看到一些解決這些問題的途徑。比如可以通過結合多個靶向位點提高結合血栓的特異性和穩定性［51］；通過選擇生物自身來源的材料，如外泌體、細胞膜等制備或包裹探針來提高生物相容性［52］。由于靶向血栓的相關靶點有一定的物種差異性，要實現動物實驗到臨床實驗的差距，還需要經歷靈長類實驗等大量的努力［53］。將來隨著更多血栓標志物的發現，更多生物安全性更高、價格更低廉的分子材料的問世，相信在不久的將來，安全性高、穩定性好、靶向準確、顯像靈敏乃至診療一體的分子靶向探針將成為研究與治療血栓性疾病的一大助力。