胰腺癌免疫治療耐藥性機制研究進展

孫敏慧 張筱鳳

胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是惡性程度極高的消化系統腫瘤，五年的生存率僅為9%［1］。胰腺癌起病隱匿，發現時往往已失去手術機會，因此目前的治療手段主要為化療、放療和新輔助治療。免疫治療是一種新型的抗癌療法，旨在激發和增強機體的抗腫瘤免疫應答，協同機體免疫系統殺傷腫瘤。目前應用于臨床的免疫療法主要有免疫檢查點抑制劑、癌癥疫苗、過繼性細胞轉移等，它們在血液系統腫瘤、黑色素瘤、肺神經內分泌腫瘤［2］中顯示出了良好的療效。然而O'REILLY［3］、WAINBERG［4］等多人的研究并未發現免疫治療明顯改善胰腺癌患者的總體生存時間和臨床控制率，其免疫治療單藥或聯合作用均不足以克服腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中的免疫抑制作用。因此探索免疫治療耐藥性機制、研究新的治療方法對胰腺癌治療至關重要。

1 腫瘤微環境

TME指由腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞及其分泌性細胞因子以及細胞外基質等通過相互作用共同構成的有利于腫瘤發生和發展的動態環境［5］。基質的致密化及大量免疫抑制細胞浸潤是PDAC微環境的特征，也是造成PDAC對免疫治療耐藥性的重要機制之一。因此打破TME，才能更好地發揮免疫治療的作用。

1.1 基質致密化 腫瘤基質由細胞外基質、脈管系統和癌癥相關的成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）組成。PDAC與許多其他腫瘤的區別在于，圍繞惡性細胞的增生基質占據了整個癌結節的80%，即所謂的“基質致密化”。CAF是促成增生反應中的主要效應細胞，而胰腺星狀細胞是CAF的最重要來源［6］。在正常的胰腺組織中胰腺星狀細胞處于靜止狀態，而胰腺癌細胞則可以通過分泌細胞因子和調節細胞內蛋白激酶的活性將其活化［7］。隨后，活化的胰腺星狀細胞會分泌基質蛋白，大量的基質不僅限制了免疫細胞的浸潤，還會增加腫瘤內部壓力，使得腫瘤內微血管管徑及分布產生差異，最終減少血液灌注，營造低氧微環境［7］。缺氧微環境可以通過低氧誘導因子-1a（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1a）激活胰腺星狀細胞，誘導胰腺癌細胞發生侵襲和細胞上皮-間質轉化過程［8］，而后者是抗程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）治療的關鍵障礙［9］。

因此，打破基質的致密化將是PDAC免疫治療的重大突破口。不管是通過局灶性粘著斑激酶［10］、聚乙二醇化人重組透明質酸酶［11］減輕TME纖維化程度，還是應用維生素D受體配體［12］將活化的胰腺星狀細胞恢復為靜止狀態阻礙腫瘤基質的產生，均能有效地減輕TME基質的致密程度，增加T細胞的浸潤，從而增強免疫治療的作用。TME中微血管被高度壓縮，在腫瘤內分布也不均衡，先前的抗血管治療在臨床前和臨床研究中均未帶來明顯收益，因此萌生了“微血管正常化”的治療策略。通過阻斷血管內皮生長因子軸使腫瘤血管正常化可以改善周細胞覆蓋和腫瘤灌注，從而通過白細胞黏附分子的作用減少微環境缺氧程度，增加CD8+T細胞的浸潤［13］，增強免疫檢查點抑制劑的療效。

1.2 免疫抑制細胞 PDAC微環境另一特征為大量的免疫抑制細胞浸潤。免疫抑制細胞被招募到TME中的機制尚不清楚，但有研究顯示PDAC細胞可以產生高水平的細胞引誘劑C-X-C基序趨化因子配體10（CXCL10）、趨化因子配體5（CCL5）和血管內皮生長因子來觸發免疫抑制細胞的浸潤。TME中的免疫抑制細胞包括腫瘤相關巨噬細胞（tumorassociated macrophages，TAMs）、髓系來源抑制細胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）、調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）等。它們能夠通過抑制自然殺傷（natural killer，NK）細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、T細胞等對腫瘤的殺傷功能，從而抑制機體的抗腫瘤免疫反應。因此靶向消融免疫抑制細胞，將會減輕胰腺癌對免疫治療的耐藥性，增強機體的抗腫瘤免疫應答。

在腫瘤組織中，巨噬細胞根據其功能可分為M1型和M2型。M1型是經典活化型巨噬細胞，發揮炎癥反應作用，殺傷腫瘤細胞；M2型是替代活化的巨噬細胞，抗原呈遞功能低下，參與誘導免疫抑制環境的形成，被稱為TAMs［14］。TAMs釋放的白介素10（Interleukin 10，IL-10）、轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等免疫抑制因子有助于Tregs募集，同時抑制NK細胞、DC、CD8+T細胞的活化，維持腫瘤的生長和免疫逃逸［15］。因此在PDAC中靶向TAMs可改善對T細胞檢查點免疫療法的反應。臨床前研究顯示抑制集落刺激因子-1（colony-stimulating factor 1，CSF-1）或集落刺激因子-1受體（colony-stimulating factor 1 receptor，CSF-1R）不僅導致TAMs耗竭，還對殘余TAMs進行了重塑，從而促進了抗原呈遞并增強了抗腫瘤T細胞反應［16］。

MDSCs是未成熟髓細胞的異質群體，具有高度免疫抑制性。MDSCs本身具有占用抗原的能力，并將其呈現給T細胞表面的主要組織相容性復合體I（major histocompatibility complex I，MHC I）類蛋白。然后這些蛋白質可以通過抑制γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）來誘導CD8+T細胞中的免疫耐受性，允許腫瘤逃逸［17］。SIRET等［18］的研究結果表明，MDSCs顯示出強的抑制能力，其特征在于抑制效應CD8+T細胞的增殖，誘導CD8+T細胞死亡以及功能分子的產生［19］。編程性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表達于巨噬細胞表面［20］，PD-L1與 PD-1相互作用將抑制T細胞的激活導致細胞周期停滯，因此抗PD-L1 / PD-1可以重新激活機體T細胞，增強抗腫瘤免疫力。

Tregs是組成性表達CD25和轉錄因子（forkhead box protein P3，Foxp3）的CD4+T細胞，它可以通過與NK細胞、抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）、DC相互作用來抑制適應性免疫以及先天免疫。Tregs可直接產生免疫抑制性細胞因子IL-10和TGF-β，表達負共刺激分子細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、PD-1/PD-L1，通過攝取［17］IL-2來抑制腫瘤特異性T淋巴細胞的功能，也可通過穿孔或顆粒酶B依賴性途徑直接殺死T細胞和APC。JANG等［21］研究顯示靶向Treg細胞可以增強DC細胞的免疫刺激潛力來促進抗腫瘤免疫作用。ZHANG等［22］使用白喉毒素將小鼠微環境中的Tregs耗竭，卻得到了與預期相反的結果。究其原因可能是PDAC晚期Tregs耗盡后CD8+T細胞的抗腫瘤作用被其他CD4+T細胞、MDSCs的代償性增加以及成纖維細胞種群的重編程所抵消導致的。

2 基因或表觀遺傳異常

PDAC患者中基因或表觀遺傳的異常將會直接影響到其對免疫治療的反應性，同時也通過減少腫瘤特異性抗原的表達或呈遞，減少效應T細胞的浸潤間接影響免疫治療的有效性。例如，腫瘤細胞中PTEN基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）［23］的表達缺失，將會抑制T細胞介導的腫瘤殺傷作用，減少T細胞向腫瘤中浸潤。若患者的腫瘤中富集某些基因的表達，并且這些基因對抗PD-1治療無反應，稱為先天性抗PD-1抗性標記。有很大一部分胰腺癌患者富含先天性抗PD-1抗性標記，這或許就可以解釋為什么胰腺癌患者會對抗PD-1治療產生耐藥性。另外最近的研究表明［24］，在T細胞染色質發生一系列遺傳和表觀遺傳改變后，活化T細胞核因子-T0X（nuclear factor of activated t cells-TOX，NFAT-TOX）軸上的基因被激活并導致反向重復（inverted repeats，IR）上調，效應子功能喪失，最終導致T細胞衰竭。當DNA錯配修復功能異常時，微衛星的復制錯誤無法糾正并且連續積累，使微衛星序列長度或堿基組成部分發生變化，這稱為微衛星不穩定性。然而微衛星區域不穩定/錯配修復缺陷表型在PDAC中發生概率僅為0.8%［25］，所以在大部分接受免疫檢查點抑制劑患者的總體生存時間及臨床控制率均無明顯提升。盡管如此，美國臨床腫瘤學會（ASCO）指南仍然建議對微衛星區域不穩定或錯配修復缺陷進行常規檢測，對測試呈陽性的患者，免疫抑制劑帕博利珠單抗（pembrolizumab）仍作為二線治療方案［26］。 研究發現，只有腫瘤內具有較多數量的克隆源性新抗原的患者，才會對免疫檢查點抑制劑治療敏感［27］。基因缺失、突變或表觀遺傳變化會導致突變新抗原的表達喪失，躲避了機體內免疫系統的識別和攻擊，從而獲得對免疫檢查點抑制劑和過繼性T細胞免疫的抗性［28］。腫瘤患者的T細胞可以破壞表達強腫瘤特異性突變抗原的腫瘤細胞，通過免疫選擇過程來塑造腫瘤免疫原性而留下表達較弱抗原或無能力的腫瘤細胞［29-30］。又或者，癌細胞可能具有腫瘤抗原，但存在抑制腫瘤抗原呈遞機制影響細胞毒性T細胞的識別，從而對免疫治療產生耐藥性。

因此通過對組織遺傳學的檢測，將會有助于明確患者是否存在耐藥的易感基因或者對免疫治療敏感的新抗原，從而有助于臨床醫生選擇合適的治療方案。

3 微生態

與正常人胰腺組織相比，PDAC患者表現出更豐富的微生物組［31］。研究者使用16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA）基因測序發現人PDAC樣本中變形桿菌（45%），擬桿菌（31%）和硬毛菌（22%）含量最高。RIQUELME等［32］也利用16S rRNA基因測序發現，相比于短期生存時間的PDAC患者，具有長期生存時間患者的腫瘤中具有豐富微生物多樣性，其中糖多孢菌、假黃單胞菌、鏈霉菌在腫瘤內顯著富集。隨后又發現CD8+和GzmB+T細胞的組織密度與微生物菌群多樣性之間存在顯著的相關性，表明多樣性的腫瘤微生物，尤其是腫瘤中這三個種屬細菌可能通過招募和激活細胞毒性T細胞改善抗腫瘤的免疫反應。

Pushalkar和Riquelme均發現了腸道菌群可以定植到胰腺癌腫瘤內而影響腫瘤細菌菌群組成。與對免疫治療產生反應的患者相比，非反應者的腸道、胰腺內微生物組成具有一定的差異，這些菌株誘導耐受性免疫抑制的微環境，有利于癌癥的發展和對免疫療法的抵抗力。基因組鼠模型的研究很好地證明了微生物組在胰腺癌發展中的作用，具有異常腸道菌群小鼠的腫瘤微環境中纖維化的程度增加、腫瘤的發育出現異常［33］。Pushalkar發現由來自胰腺癌宿主的腸道細菌提取物夾帶的巨噬細胞阻止了CD4+T和CD8+T細胞的活化，并且暗示了巨噬細胞抗原呈遞能力的降低。Riquelme將用長生存期患者的腸道菌群移植到胰腺癌模型小鼠上，發現長生存期患者的糞便微生物可以有效的激活CD8+T細胞，顯著延長小鼠的生存期。

結果發現細菌消融與TME的免疫原性重編程有關，包括MDSC減少、M1巨噬細胞分化和腫瘤內T細胞活化顯著增加，最終減輕了KPC（LSL-KrasG12D/+；LSL-Trp53R172H/+；Pdx-1-Cre）小鼠腫瘤負擔。因此，用抗生素消融微生物組可重塑腫瘤的微環境，誘導T細胞活化，改善免疫監測，并提高對已建立腫瘤的免疫治療的敏感性。同時可以對胰腺癌患者微生物組成進行基因檢測，可以將其作為對免疫療法反應的預測性生物標志物，指導更有效的治療方案。

4 總結與展望

多年來人們針對PDAC的免疫治療做出了大量的努力，但是其免疫治療的臨床療效仍然不理想。其臨床療效不佳的原因很大程度上是因為PDAC具有高度增生的基質，其間浸潤著大量TAMs，MDSCs和Tregs等免疫抑制細胞，構成了免疫治療的巨大障礙。同時PDAC是低免疫原性、低突變率、高腫瘤負荷的癌癥，三者均會造成腫瘤對免疫治療的低反應性甚至不反應。但是PDAC免疫治療的耐藥性機制至今仍不明確，這將是未來免疫治療的重點研究方向，明確其機制并且尋找相應的對策能夠更好指導臨床上PDAC的治療。