對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯對人和大鼠肝微粒體CYP450酶活性的抑制作用

史豐收，趙潺，王聰，李雅倩，余夢圓，鄭君，李萍，李賀，商靜靜，顧凌郡，陳云霞,*，蘇寧,#

1. 中國檢科院化妝品技術中心，北京 100176 2. 中檢科（北京）化妝品技術有限公司，北京 100176 3. 中國檢科院化學品安全研究所，北京 100176

對羥基苯甲酸酯（parabens, PBs），又名尼泊金酯，是對羥基苯甲酸酯類化合物的總稱。根據碳鏈碳原子數和結構的不同，可將其分為對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯和異丁酯等，是目前世界上用途最廣、用量最大、應用頻率最高的防腐劑之一。因其殺菌力強、成本低廉、對酸堿穩定等優點，PBs被廣泛應用于醫藥、食品和化妝品等行業中[1-3]。相關研究表明，對羥基苯甲酸酯類物質的酯鏈越長，通過皮膚的能力越強，吸收越多[4]。雖然研究表明，對羥基苯甲酸酯類物質可經胃腸道完全吸收、代謝并排泄，無論是對羥基苯甲酸酯類物質或其代謝物均不在體內蓄積[5]，但Darbre等[6]研究發現在人乳腺癌組織中可以檢測到對羥基苯甲酸酯類物質，人的血液、尿液、乳汁和組織均被證實可檢測出該類物質[7-9]，并且PBs可以通過胎盤屏障從而可能造成胚胎宮內暴露[10]。這說明在化妝品、食品以及藥物中添加的對羥基苯甲酸酯類物質至少有一部分可以被人體組織吸收并保留，且不能被組織中的醋酶水解成普通的對羥基苯甲酸代謝物。隨著對羥基苯甲酸酯類物質在各個領域使用的日益廣泛，其中羥苯丙酯和羥苯丁酯在化妝品中的使用頻率較高，化妝品作為人體經常使用的化學物質導致人體對羥苯丙酯和羥苯丁酯的暴露機會和吸收水平也很頻繁，再考慮到其可能在體內蓄積，因而對羥苯丙酯和羥苯丁酯安全性的評價受到學者們的普遍關注。研究證實羥苯丙酯和羥苯丁酯具有類雌激素作用，因而它們被認定為是一種內分泌干擾素（endocrine disrupting chemicals, EDCs）[11]，而且認為其不利于健康的原因，也與其雌激素樣活性有關。研究還表明，羥苯丙酯和羥苯丁酯可使未成熟雌鼠的子宮質量增加[12-13]，并對雄鼠具有生殖毒性，引起雄性動物附睪質量降低[14-15]，同時，羥苯丙酯和羥苯丁酯能抑制精子的形成[16]。

肝臟是藥物生物轉化的重要器官，含有參與藥物代謝的酶系，其中細胞色素P450 （CYP）是催化多種內、外源性物質包括菌體類化合物、藥物、環境污染物和化學致癌物進行Ⅰ相氧化代謝的重要酶系。而由CYP酶介導的代謝性相互作用在臨床上發生率最高。通過酶的抑制和誘導作用，使底物藥物的藥代動力學行為發生改變，從而引起藥效下降或毒副作用增高，影響臨床用藥的有效性和安全性。對大鼠、兔、狗和貓等的研究表明，對羥基苯甲酸酯類物質可經胃腸道迅速的吸收、代謝并排泄，在肝臟代謝為葡萄糖醛酸、硫磺酸等結合物，其安全每日容許攝入量（allowable daily intake, ADI）為0～5 mg·kg-1[17]。由于對羥基苯甲酸酯類物質被廣泛應用于醫藥、食品和化妝品等行業中，人體會經常吸收對羥基苯甲酸酯類物質，而代謝酶可以被誘導或抑制而導致代謝性藥物相互作用，所以本研究的目的是選擇使用頻率較高的對羥基苯甲酸酯類物質對羥基苯甲酸丙酯（羥苯丙酯；propylparaben, PP）和對羥基苯甲酸丁酯（羥苯丁酯；butylparaben, BP）作為研究對象，考察它們是否對肝臟細胞色素P450存在抑制或誘導作用，從而來說明對羥基苯甲酸酯類物質是否存在藥物相互作用的可能。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 儀器與試劑

羥苯丙酯和羥苯丁酯（Sigma公司），CYP探針底物非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲、咪達唑侖、香豆素、右美沙芬和氯唑沙宗（BD Gentest公司），代謝產物對乙酰氨基酚、羥基安非他酮、4’-羥基甲苯磺丁脲、1-羥基咪達唑侖、7-羥基香豆素、右啡烷和6-羥基氯唑沙宗（BD Gentest公司），混合人肝微粒體（BD Gentest公司），混合雄性SD大鼠肝微粒體（20只）為實驗室自制，NADPH（Roche公司）。

DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀（Thermo Fisher公司），Thermo Q EXACTIVE質譜儀（Thermo Fisher公司），C18 （1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱（Thermo Syncronis公司），Milli-Q AdvantageA10型超純水儀（Millipore公司，美國），KQ-250超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，中國），X-30R離心機（Sigma公司，德國）。甲酸（色譜純）、甲酸銨（色譜純）、甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純）均購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 羥苯丙酯和羥苯丁酯毒性終點預測

利用預測軟件ACD/Tox suite 2.95和ACD/ADME suite 5.0篩查羥苯丙酯和羥苯丁酯的毒性終點，重點關注主要的毒性終點，包括Eye irritation、Skin irritation、P450 Inhibitors、P450 Substrate和Oral Acute Toxicity Hazard Categories （OECD ranges）等，可以快速篩選出羥苯丙酯和羥苯丁酯的主要毒性終點。

1.3 肝微粒體孵育抑制試驗

反應體系為200 μL磷酸鉀緩沖液（pH 7.4），內含2 mmol·L-1NADPH和3.3 mmol·L-1氯化鎂，HLM或RLM（蛋白含量0.2 mg·mL-1）、CYP酶探針底物、不同濃度的受試化學物（0、0.15、0.5、1.5、5、15、50、100、200和500 μmol·L-1）。在各探針底物Km附近選擇孵育濃度[18]：非那西丁（100 μmol·L-1）、安非他酮（100 μmol·L-1）、甲苯磺丁脲（100 μmol·L-1）、氯唑沙宗（200 μmol·L-1）、香豆素（100 μmol·L-1）、右美沙芬（10 μmol·L-1）和咪達唑侖（5 μmol·L-1）。通過定量檢測對乙酰氨基酚、羥基安非他酮、4-羥基甲苯磺丁脲、6-羥基氯唑沙宗、7-羥基香豆素、右啡烷和1’-羥基咪達唑侖生成量，評價不同濃度的受試化學物對CYP同工酶活性的抑制作用。孵育試驗前將肝微粒體、探針底物和受試化學物混勻，37 ℃水浴預孵5 min，加入同樣預孵5 min的NADPH啟動反應，實驗平行3組，37 ℃孵育60 min后，移至冰上并加入500 μL含內標普萘洛爾（100 ng·mL-1）和甲苯磺丁脲（100 ng·mL-1）的甲醇-乙腈（V∶V=1∶1）終止反應，渦旋，10 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，取上清進樣分析，測定探針產物的生成量，計算相對酶活性和對應的IC50。在相同反應體系條件下，與不同濃度的底物（10、50、100、200和300 μmol·L-1）反應，測定探針代謝產物的生成量，計算不同底物濃度生成代謝產物的速率，對酶動力學數據進行非線性曲線擬合確定抑制類型，計算Ki值。

1.4 探針代謝產物的質譜定量分析

色譜條件：A為水（含0.1%甲酸和2.5 mmol·L-1甲酸銨），D為乙腈；梯度洗脫，梯度洗脫程序為0～0.5 min，30% D；0.5～1.5 min，30%～95% D；1.5～2.5 min，95%～95% D；2.5～3.5 min，95%～70% D；3.5～3.6 min，70%～30% D；3.6～6.0 min，30% D。分析時間0～6 min，每次進樣5 μL，流速為0.3 mL·min-1。色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18 1.7 μm，2.1 mm×100 mm，色譜柱溫度為30 ℃，自動進樣器的溫度保持在4 ℃。在電噴霧離子源（ESI）正負離子PRM模式下采集數據，噴霧電壓為3 500V（+）、2 500V（-）；蒸發溫度為350 ℃；鞘氣流速為40 Arb；輔助氣流速為10 Arb；毛細管溫度為320 ℃；S-lens RF為50；NCE為40。對乙酰氨基酚（152.07061/110.05973）、羥基安非他酮（256.10988/238.09824）、4-羥基甲苯磺丁脲（287.10600/89.03831）、7-羥基香豆素（161.02442/133.02922）、右啡烷（258.18524/133.06422） 、1’-羥基咪達唑侖（342.08039/324.06836）、6-羥基氯唑沙宗（183.98069/120.00903）；正內標普萘洛爾（260.16451/116.10709）；負內標甲苯磺丁脲（269.09654/170.02777）。不同代謝產物色譜圖如圖1所示。

1.5 分子對接

為了研究羥苯丙酯和羥苯丁酯與大鼠和人細胞色素P4501A2的作用模式，利用AutodockTools 1.5.6[19-20]把小鼠和人細胞色素P4501A2與羥苯丙酯和羥苯丁酯均轉化為PDBQT格式，然后利用Autodock vina 1.1.2[21]進行分子對接研究。大鼠細胞色素氧化酶CYP1A2的三維結構由建模服務器SWISS-MODEL構建得到，模板選擇人細胞色素氧化酶CYP1A2 （PDB ID：2HI4）；人細胞色素氧化酶CYP1A2 （PDB ID：2HI4，分辨率：0.195 nm）是從RCSB Protein Data Bank （http://www.rcsb.org/）下載得到。大鼠和人CYP1A2活性口袋的坐標均設置為：center_x = 2.674，center_y = 18.041，center_z = 19.672；size_x=15，size_y=15，size_z=15。為了增加計算的精確度，將參數exhaustiveness設置為20。除了特別說明，其他參數均采用默認值。最后，選取打分值最高的構象用PyMoL 1.7.6進行繪圖。

圖1 不同代謝產物的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of different metabolites

1.6 數據處理與分析

羥苯丙酯和羥苯丁酯的IC50值計算如下：通過測定撲熱息痛生成量計算CYP1A2的活性，由式（1）計算羥苯丙酯和羥苯丁酯作用下的相對酶活性，式中Erel為相對酶活性，Ci（n）為不同濃度羥苯丙酯和羥苯丁酯組測得的代謝產物生成量，Ci（0）為空白對照組的代謝產物生成量。數據處理軟件為GraphPad Prism 5，以相對酶活性Erel為縱坐標，化學物濃度的對數值為橫坐標，由抑制曲線計算IC50值。采用SPSS12.0軟件進行數據處理，試驗數據用平均值±標準偏差（Mean±SD）表示。

Erel=Ci（n）/Ci（0）×100%

（1）

2 結果（Results）

2.1 利用軟件預測的方法對羥苯丙酯和羥苯丁酯進行毒性終點篩查

由表1可知，羥苯丙酯和羥苯丁酯都對CYP1A2具有抑制作用，同時主要通過CYP1A2代謝，由于CYP450酶介導的代謝性相互作用發生率最高，通過酶的抑制作用引起藥效下降或毒副作用增高，特別是在我國中、西藥合并使用相當普遍的情況下，其可能存在藥物相互作用的風險，由表1可知，羥苯丙酯和羥苯丁酯具有眼刺激和皮膚刺激作用，同時按照OECD的分類危險范圍，它們的等級較低，但口服具有毒性，還是需要加強對它們的安全性研究。

2.2 羥苯丙酯和羥苯丁酯對大鼠和人肝微粒體CYP450酶的抑制作用

如圖2所示，在大鼠肝微粒體中，加入系列濃度的羥苯丙酯孵育60 min，得到抑制CYP1A2酶的IC50值為（8.85±0.38） μmol·L-1，對其他CYP450酶無抑制作用，加入系列濃度的羥苯丁酯孵育60 min，得到抑制CYP1A2酶的IC50值為（19.43±3.03） μmol·L-1，對其他CYP450酶無抑制作用。在人肝微粒體中，加入系列濃度的羥苯丙酯孵育60 min，得到抑制CYP1A2酶的IC50值為（1.63±0.34） μmol·L-1，對其他CYP450酶無抑制作用，加入系列濃度的羥苯丁酯孵育60 min，得到抑制CYP1A2酶的IC50值為（7.97±0.82） μmol·L-1，對其他CYP450酶無抑制作用（表2）。繼續實驗測得，在大鼠肝微粒體中，羥苯丙酯和羥苯丁酯對CYP1A2酶都是非競爭性抑制，Ki值分別為8.44 μmol·L-1和16.30 μmol·L-1。在人肝微粒體中，羥苯丙酯和羥苯丁酯對CYP1A2酶都是非競爭性抑制，Ki值分別為2.28 μmol·L-1和5.86 μmol·L-1。按照通用的CYP酶抑制劑強度分級規則[22]，對2個受試化學物的抑制強度進行分級：IC50<1 μmol·L-1強抑制劑，1 μmol·L-110 μmol·L-1為弱抑制劑?？芍笫蠛腿烁挝⒘ｓw中羥苯丙酯是中等強度抑制劑，羥苯丁酯在大鼠肝微粒體中是弱抑制劑，羥苯丁酯在人肝微粒體中是中等強度抑制劑，羥苯丙酯和羥苯丁酯對人肝微粒體CYP1A2酶活性的抑制作用強于大鼠肝微粒體，說明羥苯丙酯和羥苯丁酯對肝臟CYP1A2酶活性的抑制還存在種屬差異，同時羥苯丙酯和羥苯丁酯會經皮膚等被人體吸收，更要關注其對人體健康的危害，因為動物水平的安全研究不能體現其真實的人體危害。

表1 羥苯丙酯和羥苯丁酯的毒性終點Table 1 Toxicity endpoints of propylparaben and butylparaben

圖2 羥苯丙酯（PP）和羥苯丁酯（BP）對大鼠和人CYP1A2的抑制曲線注：（a）羥苯丙酯-大鼠CYP1A2；（b）羥苯丁酯-大鼠CYP1A2；（c）羥苯丙酯-人CYP1A2；（d）羥苯丁酯-人CYP1A2。Fig. 2 Inhibition curves of propylparaben （PP） and butylparaben （BP） on CYP1A2 in rats and humanNotes: （a） Propylparaben-CYP1A2 in rats; （b） Butylparaben-CYP1A2 in rats; （c） Propylparaben-CYP1A2 in human; （d） Butylparaben-CYP1A2 in human.

表2 羥苯丙酯和羥苯丁酯對大鼠和人肝微粒體中主要CYP450酶活性的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of propylparaben and butylparaben on major CYP450 enzyme activities in rat and human liver microsomes

2.3 羥苯丙酯和羥苯丁酯與CYP1A2的分子對接結果

為了進一步驗證羥苯丙酯和羥苯丁酯對CYP1A2的抑制作用，對它們進行了分子對接，羥苯丙酯與CYP1A2分子對接結果顯示，羥苯丙酯緊湊地結合至大鼠和人CYP1A2的活性口袋中（圖3（a）和3（b）），其親和力都為-7.4 kcal·mol-1。羥苯丙酯分別位于由大鼠氨基酸殘基Phe-124、Phe-225、Phe-259、Ala-315、Val-380和Leu-49與人氨基酸殘基Phe-125、Phe-226、Val-227、Phe-256、Phe-260、Ala-317和Leu-497所組成的疏水性腔袋，形成強烈的疏水性相互作用。由圖3（c）和3（d）可知，羥苯丙酯的苯環分別可以與大鼠氨基酸殘基Phe-124、Phe-225和人氨基酸殘基Phe-125、Phe-226的側鏈形成CH-π相互作用和π-π堆積作用。此外，羥苯丙酯的苯環可以與大鼠氨基酸殘基Asp-311和人氨基酸殘基Asp-320形成陰離子-π相互作用。重要的是，羥苯丙酯可以與大鼠氨基酸殘基Asn-310 （鍵長0.22 nm）形成氫鍵相互作用（圖3（c）），同時與人氨基酸殘基Asp-320（鍵長0.22 nm）和Ala-317（鍵長0.26 nm）形成雙重氫鍵作用（圖3（d）），這是羥苯丙酯與大鼠和人CYP1A2之間主要的作用力?？赡苷怯捎谶@樣特殊的結合模式，使得羥苯丙酯與大鼠和人CYP1A2形成穩定的復合物，從而起到抑制CYP1A2的作用。

羥苯丁酯與CYP1A2分子對接結果顯示，羥苯丁酯緊湊地結合至大鼠和人CYP1A2的活性口袋中（圖4（a）和4（b）），其親和力都為-7.7 kcal·mol-1。羥苯丁酯分別位于由大鼠氨基酸殘基Phe-124、Phe-225、Phe-259、Ala-315、Val-380、Ile-384和Leu-495與人氨基酸殘基Phe-125、Phe-226、Val-227、Phe-256、Phe-260、Ala-317和Leu-497所組成的疏水性腔袋，形成強烈的疏水性相互作用。由圖4（c）和4（d）可知，羥苯丁酯的苯環分別可以與大鼠氨基酸殘基Phe-124、Phe-225和人氨基酸殘基Phe-125、Phe-226的側鏈形成CH-π相互作用和π-π堆積作用。此外，羥苯丁酯的苯環可以與大鼠氨基酸殘基Asp-311和人氨基酸殘基Asp-320形成陰離子-π相互作用。重要的是，羥苯丁酯可以與大鼠氨基酸殘基Asn-310（鍵長0.22 nm）形成氫鍵相互作用（圖4（c）），同時與人氨基酸殘基Asp-320（鍵長0.21 nm）和Ala-317（鍵長0.27 nm）形成雙重氫鍵作用（圖4（d）），這是羥苯丁酯與大鼠和人CYP1A2之間主要的作用力?？赡苷怯捎谶@樣特殊的結合模式，使得羥苯丁酯與大鼠和人CYP1A2形成穩定的復合物，從而起到抑制CYP1A2的作用。

圖3 羥苯丙酯與大鼠和人CYP1A2分子對接注：（a）大鼠CYP1A2 （整體圖）；（b）人CYP1A2 （整體圖）；（c）大鼠CYP1A2 （細節圖）；（d）人CYP1A2 （細節圖）Fig. 3 Docking of propylparaben with rat and human CYP1A2Notes: （a） Rats CYP1A2 （overall）; （b） Human CYP1A2 （overall）; （c） Rats CYP1A2 （detail）; （d） Human CYP1A2 （detail）.

圖4 羥苯丁酯與大鼠和人CYP1A2分子對接注：（a）大鼠CYP1A2（整體圖）；（b）人CYP1A2（整體圖）；（c）大鼠CYP1A2（細節圖）；（d）人CYP1A2 （細節圖）。Fig. 4 Docking of butylparaben with rat and human CYP1A2Notes: （a） Rats CYP1A2 （overall）; （b） Human CYP1A2 （overall）; （c） Rats CYP1A2 （detail）; （d） Human CYP1A2 （detail）.

3 討論（Discussion）

參與人類藥物代謝的CYP同工酶主要有CYP1A2、2B6、2C9、2C19、2D6和3A4等，其中CYP1A2是介導藥物氧化代謝主要酶系，約占CYP總量的13%[23]，它們介導了大部分藥物的代謝，是基于CYP酶藥物相互作用的研究重點[24]。本研究在體外大鼠和人肝微粒體孵育體系中，選用美國食品藥品監督管理局（US FDA）推薦的探針底物[25]，系統評價了羥苯丙酯和羥苯丁酯對7種常見CYP酶的抑制作用，通過IC50的測定評價它們對CYP450酶的抑制活性，發現大鼠和人肝微粒體中羥苯丙酯是CYP1A2酶的中等強度抑制劑，羥苯丁酯在大鼠肝微粒體中是CYP1A2酶的弱抑制劑，羥苯丁酯在人肝微粒體中是CYP1A2酶的中等強度抑制劑，觀察到對其他CYP450酶無抑制作用，這與用軟件預測的羥苯丙酯和羥苯丁酯對CYP450酶的抑制種類結果一致，分子對接的結果也印證了羥苯丙酯和羥苯丁酯對CYP1A2酶活性的抑制作用，而且羥苯丙酯和羥苯丁酯對肝臟CYP1A2酶活性的抑制還存在種屬差異，這與文獻報道的CYP450酶存在種屬差異一致[26]。因此，為了評價受試化學物對CYP酶抑制的臨床相關性，應首選人肝微粒體，動物研究的結果外推至人時，也應充分考慮CYP酶種屬差異所致的抑制活性和機制的差異。羥苯丙酯和羥苯丁酯是對羥基苯甲酸酯類物質，它們被廣泛應用于醫藥、食品和化妝品等行業中，很容易被人體接觸和吸收，可能與CYP1A2底物藥物華法林、咖啡因、安替比林、對乙酰氨基酚、維拉帕米和硝苯地平等臨床藥物產生藥-藥相互作用，從而影響藥物的療效或增加毒副作用，所以使用含對羥基苯甲酸酯類物質產品的人群需要關注自身的用藥安全，避免出現藥-藥相互作用。但由于肝微粒體只是亞細胞結構中的組分，沒有整體細胞中其他酶（如N-乙酰轉移酶）及輔酶，因此，一些代謝反應需要通過Ⅱ相酶參與的，在該體系中就不會進行，由于藥物及其代謝產物在體外肝微粒體孵育體系中很容易接近藥物代謝酶，而不可能完全反映體內的ADME情況，同時由于肝微粒體富含CYP450s和UGTs，而不像體內和整體細胞那樣有其他的酶競爭性參與藥物代謝，所以可能導致其生物轉化率遠遠高于體內或肝細胞，不符合真實的代謝情況?？傊狙芯繌能浖A測、肝微粒體抑制和分子對接3個方面來確證羥苯丙酯和羥苯丁酯對CYP1A2酶的抑制作用以及種屬差異，下一步還需要進行動物或肝細胞水平的研究來確證該研究結果，保證將肝微粒孵育體系中的實驗結果外推到人體內的準確性。