eDNA宏條形碼監測沉積物原生生物群落多樣性

薛棋文，楊江華，張麗娟，張效偉,#，雷春生,*

1. 常州大學環境與安全工程學院，常州 213164 2. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京 210023

原生生物是由單細胞組成的微生物[1]，分布廣泛，以細菌、藻類等為食，并被后生生物等捕食，在水生食物網中占有重要地位[2]。而且，部分原生生物以水體中的碎屑或腐殖質為食，擔任著凈化水體的重要功能，是食物鏈中不可或缺的一環[3]。原生生物生長周期短，對水環境變化極為敏感，是水體富營養化重要的指示生物之一。例如富營養的湖泊與水質較好的湖泊中纖毛蟲的豐度存在巨大差異，在富營養化湖泊中纖毛蟲豐度更高[4]。

目前，原生生物監測主要基于自微型生物群落監測方法（PFU法）[5]。將泡沫塑料塊放入監測的水體中富集原生生物，帶回實驗室后使用顯微鏡人工觀察原生生物群落的組成，判斷監測水體區域的受污染狀況。雖然此方法操作易上手、成本較低，但是重污染地區原生生物聚集較慢，影響評估結果[6]，具有一定的局限性。監測沉積物中原生生物則需要將環境樣品長時間風干，使用培養皿對孢子（原生生物在干旱條件下存活方式）進行培養[7]，在顯微鏡下人工計數需要耗費大量時間與精力且保存不易。同時原生生物易受到環境因子的影響而改變自身形態這一特性對人工鑒定造成了很大的困難[8]。

環境DNA（eDNA）宏條形碼技術為監測沉積物原生生物多樣性提供了新的方法。生物參與生態過程時，會向環境中釋放含有DNA的分泌物，例如血液、糞便、脫落的組織結構等[9]。這些游離于環境中的生物DNA片段被稱為環境DNA[10]。隨著測序技術發展，高通量測序（high-throughput sequencing）因其可以一次性將數據量巨大的DNA條形碼堿基信息進行分類，使獲取環境中物種DNA信息成為了可能[11]。結合聚合酶鏈式反應技術（PCR）可以識別環境中存在的低豐度的物種信息[12]。該技術最大的特點是能夠將環境中微量存在的DNA條形碼堿基序列片段幾何數量級的擴增，從而獲得環境中生物多樣性的信息[13]。eDNA宏條形碼比傳統方法具有更高的敏感度[14]，不需要目標物種在采樣位點被觀測到[15]。eDNA技術檢測物種不直接對生物體進行采樣，具有對稀有和難以捕捉物種的實地調查能力[16]。目前環境DNA宏條形碼技術已經被用于監測魚類、浮游等水生生物中[17]，但在我國湖泊沉積物研究中尚不多見。因此本項目擬以太湖流域為對象：（1）建立基于環境DNA宏條形碼技術監測沉積物原生生物多樣性的方法；（2）評估沉積物原生生物完整性指數與水生態健康的關系。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 研究區域

太湖流域的河流、水庫和湖蕩等設置82個點位，每個點位一共采取3份等體積沉積物樣本，共采集246份樣品。分別在2019年3月和8月采集沉積物用于原生生物群落分析，采樣位點圖如圖1所示。

1.2 樣品的采集與處理

每個點位用尺寸為300 mm×208 mm×150 mm（長×寬×高）的皮特森抓泥器采集4次，抓取表層深度約5 cm的沉積物，累計采集0.125～0.25 m2，采樣過程中避免水體的擾動。將底泥混勻后取50 g裝入離心管中。每個位點采集3個平行樣品。現場用干冰保存，實驗室內用-80 ℃冰箱保存。

1.3 實驗方法

用凍干機將樣品中的水分凍干后拍打混勻，每份樣品取約0.3 mg，使用QIAGEN power soil kit 100試劑盒提取沉積物中DNA。使用18S RNA V9引物（上游引物序列CCTTCYGCAGGTTCACCTAC，下游引物序列TCCCTGCCHTTTGTACACAC）進行PCR擴增。PCR在96孔板中進行，每個96孔板均設有3個陰性對照（無菌水）。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否存在非特異性擴增。PCR反應體系如下：2×Vazyme taq酶12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、DNA樣品1 μL、無酶水10.5 μL。反應條件為：（1）在95 ℃條件下預變性3 min；（2）95 ℃變性30 s；（3）62 ℃退火30 s；（4）72 ℃延伸15 s循環；（5）重復2到4步驟循環28次；（6）末次延伸72 ℃ 5 min。

圖1 采樣位點分布圖Fig. 1 Sampling sites map

PCR產物利用Ion torrent Proton平臺進行高通量測序[18]。在EcoView軟件中去除Q<20的序列，保留讀長130～170 bp的序列；使用UCHIME軟件篩查嵌合子序列信息，避免嵌合子污染去除重復、低頻序列，保留unique序列并排除測序過程中的隨機誤差；使用USEARCH程序類聚相似度97%以上的分類單元（OTU），類聚閾值參考18S rRNA基因通用類聚標準；在Protist Ribosomal Reference database（PR2）數據庫（版本號4.14.0）進行物種信息注釋，并將注釋為古菌、細菌、葉綠體、線粒體和未知的序列去除，注釋結果從屬關系混亂的物種按照域界門綱目科屬種順序重新劃分，3份平行樣本中物種OTU出現2次及以上保留，數據四舍五入取整數均值。以上操作在Linux系統中完成。基于物種OTU水平、門水平和屬水平上分析eDNA技術區分物種alpha-多樣性的季節差異，使用T值檢驗來判定；基于OTU與屬水平上分析beta-多樣性不同季節的差異，將OTU注釋文件在R語言中進行數據統計分析。

1.4 指數計算方法

基于OTU分類單元水平與屬水平分析，使用R語言Vegan包計算alpha-多樣性與beta-多樣性。alpha-多樣性計算公式如下。

豐富度（Richness）指數計算公式：Richness即為OTU分類單元數

香農（Shannon）指數計算公式：H=-∑（Pi）×（lnPi），Pi代表個體數與總體數之比

基于OTU分類單元水平與屬水平計算方法重復性指數，公式如下所示[19]：

3個平行樣本OTU的交叉率=3×共有的OTU數目/（平行1的OTU數目+平行2的OTU數目+平行3的OTU數目）。

考慮權重的OTU交叉率=（平行1共有的序列數+平行2共有的序列數+平行3共有的序列數）/（平行1的序列數+平行2的序列數+平行3的序列數）。

至少2個平行樣本出現的OTU交叉率=（2×只在2個平行中出現的OTU數目+3×3個平行共有的OTU數目）/（平行1的OTU數目+平行2的OTU數目+平行3的OTU數目）。

1.5 原生生物完整性評估

根據上述步驟得到的數據構建原生生物完整性指數，該方法主要是篩選對環境干擾有明顯變化的原生生物多樣性指數來定量描述生物特性與環境影響因子的關系。首先根據原生生物特征篩選指標；計算出多樣性指數的分布并做相關性分析篩選合適的指數；計算原生生物指標值以及確定生物完整性指數的計算方法；確定評價標準。按照以下步驟進行構建：首先確定參考點與受損點，在以往的研究中水庫位點常被認為是生境較好的地帶，太湖流域北部的湖泊與河流均長期處于水污染影響的狀態，水質處于中國地表水標準3類水以下，故參考點選取水庫位點，受損點選取太湖北部地區位點，本研究取T1、T2、T3和T6水庫位點為參考點，取T46、T48、T72和T75河流位點為受損點，取相同位點3份平行樣本中多樣性指數均值計算原生生物完整性指數。隨著參考點與受損點變化，能夠明顯區分參考點與受損點的參數稱為顯著性差異指數，呈現上升趨勢的以5%分位數作為參考值，下降趨勢的以95%分位數作為參考值。統一的參數量綱分值計算：下降的參數分數為參考值/參數值；上升的參數分數為（最大值-參考值）/（最大值-參考值）。最后統一進行分數匯總，按照25%、50%和75%人為劃分太湖流域生態健康狀態等級。

2 結果（Results）

2.1 原生生物群落組成

利用環境DNA技術檢測出82個位點共有6 215個OTU，其中原生生物有2 468個OTU，占總序列數的13%（圖2），隸屬13門44綱（表1）。其中有70%的分類單元能注釋到種，79%的分類單元能注釋到屬，91%的分類單元能注釋到科，97%的分類單元能注釋到目，98%的分類單元能注釋到綱，99%的分類單元能注釋到門。OTU序列數優勢類群為纖毛蟲門、絲足蟲門、錐足亞門、甲藻門和頂復門等（圖2），其中纖毛蟲門分類單元占原生生物總分類單元的37%，絲足蟲門分類單元占原生生物總分類單元的30%，錐足亞門分類單元占原生生物總分類單元的10%，甲藻門分類單元占原生生物總分類單元的9%，頂復門分類單元占原生生物總分類單元的5%。

2.2 方法重復性研究

選取2次采樣位點中97個位點的樣本，樣本包含2個季度采樣重合位點，每個位點樣本包含3個平行樣本，共計291個樣本。

基于OTU計算與基于屬多樣性指數CV值分布絕大部分均處于0.15以下，可知環境DNA宏條形碼技術具有很好的方法重復性。隨機抽取1個點位（共3份平行樣本）的方法重復性研究示意圖如圖3所示。3個平行樣本均檢出的OTU占總OTU的21.7%，至少在2個平行樣本檢出的OTU占總OTU的47%。若考慮序列權重，3個平行樣本OTU交叉率達到63.50%，至少在2個平行樣本檢出的OTU所占比例達到84.25%。3個平行樣本出現的屬平均值的交叉率平均值為37.70%，至少在2個平行樣本出現的屬交叉率均值為62.15%。基于權重3個平行樣本出現的屬交叉率均值為91.33%，基于權重至少在2個平行樣本出現的屬交叉率均值為97.13%。基于OTU的多樣性指數豐富度CV值均值為12.5%；香農指數CV值均值為4.9%；均勻度CV值均值為4.5%。基于屬的多樣性指數豐富度CV值均值為9.3%；香農指數CV值均值為4%；均勻度CV值均值為3.7%，alpha-多樣性CV值分布如圖4所示。

圖2 原生生物OTU分布Fig. 2 Distribution of OTU in protist

表1 物種注釋表Table 1 Taxa annotation table

圖3 方法重復性研究示意圖注：A1～A3代表相同位點的3個平行樣本。Fig. 3 Schematic diagram of method repeatability studyNote: A1～A3 represent three parallel samples of the same samples.

2.3 原生生物群落alpha-多樣性季節差異

原生生物alpha-多樣性在不同季節存在顯著差異。對比2個季度的豐富度指數、香農指數、均勻度指數、分類單元數優勢物種門相對豐度，基于OTU分類單元水平與屬水平進行分析。T值檢驗分析整體性差異結果顯示，基于OTU與基于屬計算的豐富度指數在時間尺度上具有顯著差異，而香農指數與均勻度則未見顯著性差異（圖5）。基于OTU計算的原生生物優勢物種豐富度指數，在不同季節中具有顯著差異類群為纖毛蟲門、甲藻門、頂復門和盤嵴亞界（圖6）。

2.4 原生生物群落beta-多樣性

進行春季（3月）和秋季（8月）原生生物群落主成分（PCA）分析，區分時間尺度上群落結構的變化。不同季節原生生物群落結構差異不顯著（圖7）。

2.5 利用原生生物完整性指數評價水生態健康

不同季節指標篩選：本研究篩選了2個季度15個評價參數（表2）。甲藻門豐富度、甲藻門香農指數、甲藻門相對豐度和纖毛蟲相對豐度4個指數在3月的參考點與受損點之間具有顯著性差異；纖毛蟲香農指數、絲足蟲豐富度、基于OTU的香農指數和基于OTU的豐富度在8月的參考點與受損點之間存在顯著性差異（圖8）。

3月的各類指數中，參考點與受損點之間甲藻門豐富度、甲藻門香農指數和甲藻門相對豐度呈下降趨勢，纖毛蟲相對豐度呈上升趨勢。8月的各類指數中，參考點與受損點之間基于OTU的豐富度、香農指數、絲足蟲豐富度和纖毛蟲香農指數均呈下降趨勢。生物完整性指數校正表如表3所示，春季（3月）與秋季（8月）水生態健康評分標準如表4所示。評價結果顯示，3月與8月采樣位點生態健康等級具有一致性（圖9）。

圖4 alpha-多樣性指數CV值Fig. 4 CV value of alpha diversity index

圖5 多樣性指數非獨立樣本T值檢驗注：**代表P<0.001；***代表P<0.0001；ns表示不顯著。Fig. 5 T value test of non independent samples based on OTU diversity indexNote: **represents P<0.001; ***represents P<0.0001; ns represents not significant.

圖6 不同采樣季節對原生生物優勢物種的影響注：*代表P<0.05，**代表P<0.001，***代表P<0.0001；ns表示不顯著。Fig. 6 Effects of different sampling seasons on dominant protist speciesNote: *represents P<0.05; **represents P<0.001; ***represents P<0.0001; ns represents not significant.

表2 指數篩選表Table 2 Index screening table

圖7 原生生物群落PCA分析Fig. 7 PCA analysis of protist community

圖8 原生生物完整性差異指數Fig. 8 Protist community index screening

表3 指數校正表Table 3 Index correction table

圖9 太湖流域生態健康等級分布Fig. 9 Distribution of ecological health grades in Tai Lake Basin

表4 原生生物完整性指數標準Table 4 Integrity index standard of benthic protist

3 討論（Discussion）

3.1 生物信息數據庫

準確的原生生物監測仍然需要進一步完善本土物種DNA條形碼數據庫。由于我國還未建立本土原生生物物種注釋數據庫，本次原生生物的注釋采用的是國際通用的PR2數據庫，仍然存在無法注釋的OTU，注釋結果并不能完全包含太湖流域沉積物原生生物信息，未來尚需開展大規模的本土物種DNA信息建庫的研究工作。

3.2 eDNA技術的重復性評價

環境DNA宏條形碼技術在監測與評價生物系統多樣性方面體現出了極大的應用潛力[20]，但是關于該技術對沉積物原生生物監測的重復性與穩定性的研究較少[21]。精準度會影響監測結果在時間尺度與空間尺度上的比較[22]，重復性是一個重要的衡量依據，體現了一項監測技術的穩定性與可行度[23]。使用環境DNA技術分析的對象主要是OTU[24]，因此基于分類單元的技術重復性分析結果舉足輕重。本研究中發現雖然至少在2個平行樣本中檢出的OTU的平均交叉率只有47%，但是基于序列權重的交叉率達到84.25%，說明平行樣本間共有的OTU覆蓋了絕大多數的優勢物種，某一個平行中特有的OTU主要為低豐度OTU，在環境中分布不均勻，并不影響技術重復性研究的最終結論，這一現象側面反映了環境DNA技術具有極高的獲取環境中物種信息的能力。

3.3 沉積物原生生物多樣性的季節差異

基于OTU與基于屬計算的原生生物alpha-多樣性指數在豐富度上存在著顯著性差異，然而其他指數并不存在類似差異，豐富度指數表示OTU的分類單元數，說明3月原生生物群落比8月具有更多的種，而8月原生生物群落在豐度、分布上與3月差別并不明顯。beta-多樣性在季節上差異不顯著，這可能是由于沉積物中的環境DNA存在隨著時間的累積過程，反映的是近段時間內生物組成，另外，相比水樣中的DNA，沉積物DNA受外界溫度、光照、水流等因素影響更小。

3.4 環境DNA技術監測沉積物原生生物的展望

利用水環境中的各種生物多樣性參數的指標來評價生境整體的好壞，這些指標被稱為水質生物評價參數[25]。國內使用該方法評價生態健康已有60多年，相比理化參數，生物指數可以更加直接地指示生態健康。水體中的原生生物主要生活在沉積物中，遷移活動依靠水流等被動作用，因此生物活動位置較其他水體生物穩定[26]。沉積物是污染物長期匯集的場所，易受污染的影響而改變群落結構與生物多樣性[27]，所以沉積物原生生物群落的各種生物多樣性指數可以反映長期以來水環境生態健康狀態[28]。

太湖流域一直以來是環境監測評價研究的熱點地區，大多數研究基于浮游動植物[29]、水體大型生物如魚類[30]開展研究，鮮有研究關注沉積物中的原生生物群落[31]。在環境DNA技術的支撐下，構建基于原生生物完整性指數用于評價水生態健康[32]，使用原生生物完整性指數來評價水生態健康具有一定意義上的方法學補充與數據參考價值[33]，但參考點與受損點的選取不可避免存在著研究人員的主觀因素，不能完全代表監測區域的水生態健康狀態。常規監測中，建議使用沉積物原生生物群落來構建生物完整性指數用于評價長期的生態健康狀態。沉積物中污染物濃度與組成更多反映了水環境長期的變化趨勢，起伏較低、更為穩定，同時不受光照等影響，底層水溫主要受季節變化的影響，溫度變化波動較小。

環境DNA技術為彌補了傳統監測方法的不足[34]，不依賴于專業物種鑒定專家，更加快速高效且可標準化，不需要對沉積物原生生物進行培養，降低了時間成本[35]，避免了因培養條件限制而遺漏重要物種的可能性。未來通過進一步的技術研發，如數據庫完善、方法的標準化，可實現在實際的水生態環境監測和評估上的廣泛應用。