TLR4/Akt相關分子在DMF暴露小鼠肝損傷中的作用

桑靈麗，王揚眉，李宏慧，肖靜

南通大學公共衛生學院職業衛生與環境毒理學教研室，南通 226019

二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide, DMF）因其理化性質優良而在工業生產和生活消費領域廣泛應用，使用或生產過程中DMF可向土壤、水體和大氣等環境介質擴散蓄積，并通過呼吸、皮膚或消化等途徑進入機體[1]。代謝動力學實驗表明DMF主要經肝細胞色素P450家族成員2E1代謝生成異氰酸甲酯等活性代謝產物，從而引起肝臟、腎臟和心臟等多系統毒性，其中尤以肝臟損害最為顯著[2-4]。體內外實驗均證實DMF可引起肝細胞凋亡、肝酶異常，還可增加機體對其他外源化合物的敏感性[5-7]。對此有研究歸結于活性氧（ROS）有關的氧化應激級聯反應，但同時也有研究通過基因敲除小鼠和人群丙二醛水平分析等結果推測，在DMF暴露中存在與氧化應激無關的損傷方式[7-9]，但迄今為止DMF肝損害效應的具體途徑和相關分子尚不明確。

Toll樣受體4（toll-like receptors 4, TLR4）作為一種先天免疫因子，已被證明在汞、砷和環境有機污染物等多種外源化學物所致肝損傷中發揮作用，可在內、外源信號誘導下，通過宿主繼發危險相關分子模式激活下游靶標如核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）、蛋白激酶B（protein kinase B, Akt），誘發與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor, TNF-α）、白介素1和白介素6等相關的炎性反應，還可經p38絲裂原活化蛋白激酶-自噬蛋白P62信號軸，通過c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）級聯活化方式誘導肝細胞自噬和炎性反應，最終造成肝細胞損傷[10-12]。研究報道DMF暴露動物在出現消化道損害同時，可伴隨S24-7、類桿菌科、理肯菌科和消化鏈球菌科等菌群數量改變，并推測此現象可能會間接影響Toll受體相關信號而誘導肝腦損害[13-14]。但截至目前，對于TLR4是否在DMF所致肝損傷中發揮作用及其涉及的具體分子尚不清楚。

鑒于以上原因，擬通過動物實驗考察DMF對小鼠肝臟損害效應表現及對TLR4相關分子表達的影響，借此探討DMF肝損傷的潛在機制與可能途徑，為DMF生態毒理學研究提供基礎數據。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試劑與儀器

試劑：DMF（Assay LC-MS 98%，Sigma-Aldrich公司，美國）；RT-PCR試劑及引物（TaKaRa大連寶生物公司，中國）；丙氨酸轉氨酶試劑盒、谷草轉氨酶試劑盒和堿性磷酸酶試劑盒（Applied Biosystems公司，美國）；白細胞介素-1、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-αElisa試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，中國）；其他試劑均為國產分析純。

儀器：5332型PCR儀（Eppendorf公司，德國）、MODEL550酶標儀（Bio-Rad公司，美國）、RM2126切片機（Leica公司，德國）、CK40顯微鏡（Olympus公司，日本）、CFI60數碼相機（Nikon，日本）。

1.2 動物模型建立

雌雄各半ICR小鼠80只，雄性（23±2） g，雌性（20±2） g，上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供（SCXK滬2008-0016），實驗室馴養1周后隨機分為對照組（0 mg·kg-1·d-1,n=20）、低劑量組（350 mg·kg-1·d-1,n=20）、中劑量組（700 mg·kg-1·d-1,n=20）和高劑量組（1 400 mg·kg-1·d-1,n=20）。

1.3 指標檢測

1.3.1 臟器系數

小鼠處死前稱量質量，處死后用預冷生理鹽水漂洗肝臟，濾紙吸干稱取肝質量計算臟器系數：臟器系數=臟器質量（g）/小鼠體質量（g）×100%。

1.3.2 肝臟病理觀察

肝臟組織用10%中性福爾馬林溶液固定，常規脫水后石蠟包埋制備4 μm切片，蘇木精-伊紅（HE）、油紅O染色后顯微鏡觀察其病理學變化。

1.3.3 肝臟組織勻漿中指標的檢測

按照測試盒說明書進行操作，測定肝臟組織勻漿中丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性以及總膽固醇（total cholesterol, TC）和甘油三酯（triglyceride, TG）含量。

1.3.4 肝臟蛋白質提取及蛋白印跡反應（Western blotting, WB）

稱取約100 mg小鼠肝臟組織進行蛋白質提取，置于95 ℃水浴鍋蛋白變性10 min，并于-20 ℃冰箱保存備用。根據實驗目的，配制不同濃度的SDS-PAGE膠，80 V電壓下分離30 min左右，直至marker顏色分開，切換至120 V電壓直至結束，對蛋白質進行電泳分離。電泳結束后，在濕轉轉膜緩沖液中將SDS-PAGE膠上的蛋白轉移至甲醇活化的PVDF膜上，100 V，濕轉70 min。轉膜結束后，加入適量含5%牛奶的TBST，室溫輕搖封閉1 h，結束后一抗4 ℃孵育過夜。次日，一抗回收，TBST清洗（5 min×3次）。HRP偶聯二抗室溫孵育1 h，TBST清洗（5 min×3次）。用ECL發光液孵育約3 min，放入Tanon-5200全自動化學發光圖像分析系統拍攝，后用Image J軟件分析。

1.3.5 ELISA法測小鼠肝臟中炎性因子水平

稱取小鼠肝臟組織約100 mg勻漿，用ELISA法測試小鼠肝臟中炎性因子白介素1（IL-1）、白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的活性。將試劑盒在室溫下放置20 min后，從鋁箔袋中取出所需板條。在標準品孔、空白孔、樣品孔按照說明書加入所需試劑及待測樣品，將帶有辣根過氧化物酶標記的抗體加入每個孔中，空白孔除外，然后用封板膜封住反應孔并于恒溫箱溫育60 min或水浴鍋水浴37 ℃。棄去液體，殘余水分拍干后加入洗滌液，放置1 min，棄去洗滌液，拍干，重復洗5次。在每個孔中加入A液和B液，37 ℃避光孵育15 min后，加入終止液，于15 min內在450 nm波長處測OD值。

1.4 統計學分析

2 結果（Results）

2.1 DMF暴露對小鼠一般狀況的影響

DMF暴露小鼠均出現不同程度活動遲緩，伴隨毛發暗淡，脫毛。隨暴露劑量及周期增長，出現明顯易激惹，個別實驗動物出現腹瀉，鼻衄。

如表1所示，實驗第5周時，高劑量組小鼠體質量（35.96±5.24） g與對照組（40.61±5.77） g相比開始出現顯著降低，低、中劑量組小鼠雖也出現了體質量減少（（40.06±5.55） g、（38.81±5.29） g），但與對照組相比差異并不顯著。第12周時中、高劑量組小鼠體質量分別為（41.82±6.12） g和（39.62±6.19） g，相比對照組（46.87±6.90） g分別降低了約10.79%和15.48% （P<0.05）。此同時，DMF暴露造成小鼠肝質量的增加，不同劑量組小鼠肝臟系數與對照組相比均顯著增加（P<0.05），如表2所示。

2.2 DMF暴露對小鼠肝臟形態影響

對各組小鼠肝臟形態進行比較，光鏡下HE染色如圖1所示，肝索排列整齊，細質均勻，細胞核著色清晰可見，DMF暴露組可見不同程度炎細胞浸潤遷移，細胞空泡出現和細胞核偏移。油紅O染色結果如圖2所示，與對照組相比，暴露組小鼠細胞質及細胞間隙充斥著大量脂肪滴。

2.3 DMF暴露對小鼠肝臟代謝酶水平影響

對DMF暴露后小鼠肝臟勻漿中肝功能相關酶活性進行了檢測，結果如表3所示，和對照組相比DMF暴露造成中、高劑量組ALT、AST和ALP含量顯著上升（P<0.05），其中ALT和AST隨暴露劑量增加而顯著上升。對肝臟代謝產物的檢測發現，TG和TC的水平都在DMF暴露組出現了增加，但TC僅在高劑量組出現顯著增高，其中高劑量組和低劑量組相比也表現出顯著的增加。

2.4 DMF暴露對小鼠肝臟中相關蛋白水平的影響

如圖3所示，通過對DMF暴露小鼠TLR4相關通路蛋白質表達水平的檢測發現，TLR4的表達隨著DMF劑量增加顯著上升，分別約是對照組的1.30倍、1.55倍和1.98倍，其下游分子Akt和NF-κB的磷酸化改變趨勢與之類似，均隨著DMF劑量的增加而顯著增高（P<0.05）。

2.5 DMF暴露對小鼠肝臟中炎癥因子的影響

如表4所示，ELISA結果顯示小鼠肝臟中炎性因子IL-1、IL-6和TNF-α隨著DMF暴露劑量的增加而增加。與對照組相比，IL-1水平在中、高劑量組出現顯著升高，尤其高劑量組中達到最高，約為對照組4倍左右（P<0.05）。此外，和對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組IL-6活性分別升高約1.15倍、1.35倍和1.86倍，并有隨著劑量在組間逐漸上升的趨勢（P<0.05）。TNF-α水平在中、高劑量組相較對照組也分別升高約1.86倍和2.76倍（P<0.05）。

表1 二甲基甲酰胺（DMF）暴露對小鼠體質量的影響Table 1 Effect of N,N-dimethylformamide （DMF） exposure on body weight of mice

表2 DMF暴露對小鼠肝質量和臟器系數的影響Table 2 Effect of DMF exposure on liver weight and organ index of mice n=20）

圖1 DMF暴露后小鼠肝臟HE染色注：（a）、（b）、（c）和（d）分別代表對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組（×400），n=20；黑色箭頭表示空泡，紅色箭頭表示炎性細胞。Fig. 1 HE staining of mouse liver after DMF exposureNote: （a）, （b）, （c）, and （d） represent the control group, low-dose group, medium-dose group, high-dose group （×400）, n=20; the black arrows indicate vacuoles, and the red arrows indicate inflammatory cells.

圖2 DMF暴露后小鼠肝臟油紅O染色注：（a）、（b）、（c）和（d）分別代表對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組（×400），n=20；黑色箭頭表示脂肪滴。Fig. 2 Mice liver oil red O staining after DMF exposureNote: （a）, （b）, （c）, and （d） represent the control group, low-dose group, medium-dose group, high-dose group （×400）, n=20; the black arrow shows the fat drop.

3 討論（Discussion）

DMF屬于人類健康領域優先研究的4種污染物之一，具有明顯的肝臟毒性，但具體機制未明[15]。本次實驗發現DMF能引起小鼠肝臟酶學及形態學的顯著改變，伴隨脂質代謝產物的水平升高，這與前人對不同途徑接觸DMF的嚙齒類及人、兔等種屬研究的結果類似[16-17]，提示亞慢性DMF暴露可造成以肝脂代謝紊亂為特征的肝損傷表現。為進一步了解DMF毒效應機制，對TLR4及相關分子表達進行了檢測。

TLR4屬于宿主應答反應中的一種細胞表面受體分子，在天然免疫和炎癥反應中具有中心樞紐作用[18]。除了其經典配體脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）外，近年研究發現TLR4也可被包括環境內分泌干擾物在內的多種外源化合物所響應，通過識別病原相關分子模式及危險相關分子模式活化下游銜接分子如髓樣分化因子88、β干擾素TIR結構域銜接蛋白等，最終調節信號依賴性轉錄因子活性，參與后續肝臟炎性損傷，被認為是急慢性肝損傷中重要一環[10-11, 19-21]。

TLR4的損傷效果與其對下游分子Akt的調控活化關系密切（圖4）。TLR4可通過轉錄調節或誘導胞內磷脂酰肌醇激酶調節亞基P85活化來上調Akt磷酸化水平。活化的Akt通過上調固醇調節元件結合蛋白1c核積累、激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白受體、誘導肝X受體活化的方式上調脂肪酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶等表達促進脂質合成。研究發現野生型C3H/HeN小鼠和TLR4基因突變的C3H/HeJ小鼠相比具有更高的肝臟脂肪蓄積和炎性改變[22]。此外PM2.5暴露研究也發現TLR4可通過調節Akt反饋調節因子STAT3水平影響肝臟瘦素分泌，造成脂代謝異常[23-24]。反之，TLR4拮抗劑或敲除沉默均對緩解或阻斷與下游Akt相關的脂毒性反應有效[25-26]。但同時作為增殖調控和糖脂代謝的交叉調節分子，細胞代謝失衡可促使Akt招募活化IκB激酶（IκB kinase, IKK）復合物并降解NF-κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa-B, IκB），使其轉位入核調節下游靶基因轉錄，促進炎性免疫[27]。Shen等[28]通過藥物抑制TLR4表達，發現能緩解Akt/NF-κB激活的炎性反應，從而降低大鼠卵巢細胞凋亡。此外TLR4下游分子MyD88的抑制劑可通過阻滯Akt磷酸化及下調IκB活性的方式減少NF-κB活化，抑制RAW 264.7細胞中LPS所引起的炎性損傷[29]。在本次實驗中隨著DMF暴露劑量的增加，TLR4表達水平出現明顯增加，同時伴隨下游Akt/NF-κB磷酸化水平的提升，與之同步的是血清中TG和TC的上升及肝細胞中脂滴數量的增加。由此推斷，DMF首先通過激活TLR4/Akt造成了脂代謝通路的亢進，引起細胞中脂肪蓄積增多，正常情況下，肝系統通過加快轉運和脂肪酸氧化來對抗脂肪合成，但隨著血中游離脂肪酸水平及細胞脂變性加重超過機體代償，又作為外源性誘因刺激Akt加快上調NF-κB，觸發終末炎性反應回路。

圖3 DMF對小鼠蛋白表達水平的影響注：*與對照組相比，P<0.05。Fig. 3 Effect of DMF on mouse protein expression level n=20）Note: *indicates P<0.05 compared with control group.

圖4 TLR4相關分子在DMF致小鼠肝損傷中的作用方式Fig. 4 TLR4 activation leading to liver injury with DMF exposure

表3 DMF暴露對小鼠血清肝代謝酶的影響Table 3 Effect of DMF on liver metabolic enzyme activity in serum of mice n=20）

表4 DMF對小鼠炎癥因子活性的影響Table 4 Effect of DMF on the activity of inflammatory factors in mice n=20） （pg·mL-1）

作為炎性網絡的中心環節，NF-κB活化后將通過轉錄因子調控方式上調促炎細胞如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等的表達。作為最早最重要的炎癥介質，TNF-α能激活中性粒細胞和淋巴細胞促使白介素合成與釋放，生成的IL-1和IL-6不僅刺激T細胞、巨噬細胞分泌各種趨化因子，還能增加肝細胞合成急性期蛋白引起肝細胞凋亡[30]。與此同時，以上促炎因子也能介由二酰基甘油和神經酰胺等第二信使作用激活絲裂原活化蛋白激酶通路，反向上調NF-κB并形成炎性環路[31]。在前人開展的體外實驗中DMF可通過誘導高水平促炎因子如TNF-α、IL-1等分泌造成H9c2細胞凋亡，以往發現的DMF相關肝損傷模型中，同樣存在TNF-α、IL-1等的顯著上升[32-33]。據此有理由推斷DMF有能力通過上調TLR4/Akt/NF-κB途徑激活細胞炎性反應，并形成NF-κB與促炎因子的自調節反饋環路，造成炎性關系網的惡性往復，延長炎性反應時間，最終導致肝細胞凋亡和肝臟損傷的不良結局。

綜上所述，通過本研究發現DMF亞慢性暴露可造成ICR小鼠出現肝臟脂代謝紊亂、肝細胞凋亡，最終出現肝損傷的不良結局。我們推測DMF誘導TLR4的表達上調是這一現象的開端，此后TLR4通過上調Akt活性影響下游NF-κB相關的炎性反應網絡，造成肝臟免疫炎性調控失代償而最終導致肝臟損傷的結局。