北京市密云某私采金礦礦洞廢水對大型溞的急性毒性研究

李珊，王瀟逸，劉軍，張雅楠，王元鳳,2,*

1. 中國政法大學證據科學研究院，北京 100191 2. 法庭毒物學公安部重點實驗室，北京 100191

冶金工業作為一項重要的重金屬工業項目，生產流程各成系列，產生的大量廢水中含有重金屬離子、劇毒氰化物、硫化物和酚等污染物質，是污染環境的主要廢水之一。已有研究表明工業廢水和城市廢水現已成為了環境水體中內分泌干擾物（EDC）的主要來源[1-3]。

根據冶金工藝的不同，冶金工業被分為鋼鐵工業和有色冶金工業。鋼鐵工業廢水中主要含有酸、堿、酚、重金屬及氰化物等有害物質。有色冶金工業又分為火法冶金和濕法冶金2種。相對而言，濕法冶金所排放的廢水成分更為復雜且含量更高[4]，其中很多物質的含量明顯超過了標準和工藝要求。冶金廢水中含有的氰化物、重金屬和酚等有毒物質，會對接觸的生物造成嚴重危害，也會對環境造成不可估量的損害。廢水中的某些物質雖無毒，但大量積聚就會對水體有害，如排入水體的有機物和無機物。有機物超標，水體會出現厭氧腐敗；無機物含量過高，會對水中生物有嚴重影響，含有氮磷等物質則使水體富營養化，破壞生態平衡。

為了減少冶金廢水對生態環境的污染和破壞，廢水處理部門和研究人員針對不同成分的冶金廢水采用不同方法進行處理。黃龍等[5]提出使用低溫熱法短流程脫氨技術處理氨氮廢水，并將此方法應用到實際廢水處理環節中。此方法氨氮去除率高且能耗低，沒有二次污染，可實現資源循環利用。薛柯等[6]用斑馬魚胚胎、發光細菌和小鼠L929細胞3種模式生物進行急性毒性實驗，檢測了厭氧-缺氧-好氧（A2/O）處理工藝對4種行業（生活廢水、綜合廢水、化工廢水和制藥廢水）、6家廢水處理廠的總進水和總出水的毒性效應及毒性削減情況。結果顯示經過處理后的總出水仍具有一定的綜合生物毒性；斑馬魚胚胎的毒性敏感程度整體最高。

大型溞（Daphniamagna）是一種常見的實驗室模式生物，因具有對水質敏感、個體小、生活周期短、生長快等多種優點，被廣泛應用于環境中各類毒害物質的監測。大型溞已被證明對重金屬[7-9]、有機物[10-11]和農藥[12-13]等多種毒性物質反應靈敏，可表征急性毒性。謝希琳[14]等通過使用脈沖暴露方式來模擬大型溞在自然環境中的暴露方式，研究了三價砷和五價砷對大型溞的急性毒性。結果顯示在多種暴露方式中，三價砷的毒性效應均遠高于五價砷；在不同脈沖暴露模式下，脈沖暴露的時間間隔越長，大型溞對砷的耐受性越強。楊京亞等[15]研究了大型溞及斑馬魚在含腈綸廢水中的急性毒性和遺傳毒性，并對厭氧-好氧工藝對廢水毒性的削減能力進行了評價，發現腈綸廢水能使斑馬魚肝細胞中的彗星尾矩顯著性變長，造成肝細胞DNA損傷。腈綸廢水對大型溞也有明顯的急性毒性。此外，經處理后廢水的遺傳毒性仍顯著高于陰性對照組。

本研究基于真實環境損害案件，實驗中使用大型溞作為指示生物，對北京密云某私采金礦礦洞中發現的廢水進行生物急性毒性檢測，目的是為相應的案件審判提供技術依據。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗水樣

廢水樣品瓶為1 L藍色廣口玻璃瓶。樣品瓶使用前用重鉻酸鉀溶液浸泡過夜，再用自來水、蒸餾水反復沖洗，倒置晾干。為全面檢測礦洞中廢水的生物毒性，實驗人員在礦洞廢水池中設置了5個不同位置的取樣點（圖1），實驗人員于2020年11月9日進入礦洞進行水樣采集，將采集的水樣裝入樣品瓶，廢水應充滿樣品瓶，防止可能含有的揮發性污染物損失。分別標注為水樣1～5，封口膜密封后放入4 ℃車載冰箱帶回實驗室后立即放入4 ℃冰箱備用。

圖1 水樣采集位置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of sample collection location

實驗水樣無味，呈黃色透明狀，取回后在實驗室對其進行酸堿性檢測，結果顯示上述5個水樣全部為弱堿性（pH約為9.5）。經預實驗測定發現，未經稀釋的水樣中含有具有揮發性的物質，且揮發性物質可導致大型溞死亡。由本實驗背景案件信息可知，廢水由氰化法私采金礦產生，根據其開采工藝推斷廢水中應含有氰根離子和金屬元素，因此依據《水質氰化物的測定容量法和分光光度法 第二部分 異煙酸-吡唑啉酮分光光度法》（HJ 484—2009），開展了廢水中總氰化物的檢測，檢測結果如表1所示；依據《水質65種元素的測定 電感耦合等離子體質譜法》（HJ 700—2014），使用ICP-MS方法進行金屬元素檢測，水樣中的主要金屬成分及含量如表2所示。

1.2 受試生物與培養條件

實驗選用的大型溞已在本實驗室經過50代以上的單克隆培養及馴化。大型溞以小球藻為食，實驗過程中，每2天喂食一次，喂食濃度約為1.5～3.6×106cell·mL-1，急性活動抑制實驗過程中不喂食，培養過程中每天對新生幼溞進行一次篩選，以保證幼溞的一致性，實驗時在顯微鏡下挑選體型飽滿，身體健康的大型溞所產的出生24 h內的幼溞進行毒性試驗。

大型溞在人工智能光照培養箱（Percival-DR-36VL, PERCIVAL科技公司，美國）中培養，溫度為（23±1） ℃，光暗周期為16 h L: 8 h D。大型溞養殖水為曝氣的自來水（曝氣時間>96 h），經測定，該水的pH為8.0±0.2，氧氣含量≥4 mg·L-1；總有機碳<2 mg·L-1；游離氨<1 μg·L-1；游離氯<10 μg·L-1；硬度為（210±22） mg·L-1（以CaCO3計），電導率<4×10-2S·m-1。

表1 廢水水樣中總氰化物檢測結果Table 1 Detection results of total cyanide in sewage samples

表2 廢水水樣部分金屬元素的檢測結果Table 2 Detection results of metal elements in sewage samples （mg·L-1）

1.3 實驗條件及方法

急性毒性實驗參考《化學品 溞類急性活動抑制試驗》（GB/T 21830—2008）[16]和《水質 物質對溞類急性毒性測定方法》（GB/T 13266—1991）[17]。

實驗中所用養溞容器均為250 mL玻璃燒杯，每次使用前用洗衣粉、自來水和蒸餾水依次沖洗并經高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。在每個處理后的燒杯中放置200 mL培養液，飼養20只大型溞。

將每個水樣設置8個實驗組和1個對照組，對照組內不添加水樣，每個實驗組設置3個平行，實驗組為水樣稀釋液，稀釋倍數分別為原濃度的50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1 600倍、3 200倍、6 400倍和12 800倍，濃度公比為2，稀釋方式為梯度稀釋。

重鉻酸鉀設置了7個實驗組和1個對照組，實驗組濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6和3.2 mg·L-1，濃度公比為2，這些濃度由1 g·L-1的母液稀釋為100 mg·L-1后配制而成。所有濃度均設置3個平行。

整個實驗過程中實驗人員需及時觀察并記錄大型溞的運動與死亡情況。

1.4 實驗質量控制

設置了對照組，用未添加水樣的飼養水作為對照，此外還設置了重鉻酸鉀溶液組來驗證大型溞的敏感性。每組實驗實驗前和實驗期間都進行水質測定，以分析實驗過程中溫度、pH和溶解氧結果與實驗前相比有無明顯差異。

2 結果（Results）

2.1 大型溞形態變化

在大型溞培養24 h時，對各實驗組和對照組的形態進行觀察并記錄。通過觀察發現，對照組中的大型溞能正常生長，肢體完好（圖2（a））；使用1～5號水樣直接培養大型溞24 h后，實驗組的大型溞均出現心跳緩慢、肢體殘缺、腐爛嚴重且眼部彌散，胸肢出現間歇式抽動、缺損，尾刺彎曲，較為嚴重的身體還會發生形變，發生較大的畸形變化；重鉻酸鉀溶液中培養24 h后，大型溞身體發生形變，但尾刺未發生彎曲，部分溞體內有氣泡狀組織或潰爛，生命狀態與水樣處理組比相對較好，心跳頻率較快，但胸肢擺動仍然不規律。圖2（b）～（d）展示了部分畸形或形態嚴重改變的大型溞。

圖2 對照組大型溞（a）和畸形或形態嚴重改變的大型溞（b）～（d）注：（b）大型溞的眼部彌散；（c）大型溞產生了嚴重形變；（d）大型溞胸肢變形嚴重，尾刺彎曲，體內有氣泡狀組織。Fig. 2 Normal Daphnia magna in control group （a）, deformed or severe morphological changed Daphnia magna （b）～（d）Note: （b） Daphnia magna’s eyes are diffused; （c） Daphnia magna is severely deformed; （d） Daphnia magna’s thoracic limbs are severely deformed, its tail spines are bent, and there are bubble like tissues in its body.

2.2 大型溞活動受抑制數量

對各實驗組和對照組培養24 h及48 h后活動受抑制的大型溞數量進行統計，5個水樣的大型溞活動受抑制率如表3和表4所示。

分析結果發現，大型溞在稀釋50倍的水樣中培養24 h時，已開始全部受抑制。當水樣濃度稀釋倍數達到12 800時，水樣1、2、3中的大型溞完全不受抑制。

培養48 h后，當水樣濃度稀釋100倍時，水樣3和水樣5中的大型溞有少部分未受抑制，隨著水樣稀釋倍數的不斷增大，抑制率明顯降低，當稀釋倍數達到12 800時，水樣1、3、5中的大型溞完全不受抑制，能夠生存并自由活動。

對比培養24 h和48 h各濃度水樣中的大型溞活動受抑制率數據可知，水樣為同一稀釋倍數時，培養48 h時大型溞的活動受抑制更明顯。

2.3 廢水水樣對大型溞的急性毒性

5個水樣的劑量-效應曲線如圖3，經計算可得大型溞培養24 h和48 h后半數被抑制時水樣的稀釋倍數，如表5所示。

表3 培養24 h后大型溞活動受抑制率Table 3 Inhibition rate of Daphnia magna activity after 24 h culture （%）

表4 培養48 h后大型溞活動受抑制率Table 4 Inhibition rate of Daphnia magna activity after 48 h culture （%）

對比實驗24 h和48 h數據，發現水樣1的稀釋倍數都相對較大，這說明水樣1的毒性相比其他4個水樣更大。培養48 h的稀釋倍數均大于培養24 h的稀釋倍數，說明隨著培養時間變長，廢水的毒性有不斷變大的趨勢。

表5 大型溞培養24 h和48 h后半數抑制時水樣稀釋倍數Table 5 Dilution ratio of sample at 50% inhibition after 24 h and 48 h culture of Daphnia magna

根據《化學品分類和標簽規范 第28部分：對水生環境的危害》（GB 30000.28—2013）[18]中危害水生環境物質的分類標準規定，48 h的甲殼綱類生物動物的LC50≤1 mg·L-1，可認定為急性類別Ⅰ。培養48 h時，1號廢水水樣中總氰化物EC50為0.07 mg·L-1，2號水樣中總氰化物EC50為0.07 mg·L-1，3號水樣中總氰化物EC50為0.59 mg·L-1，4號水樣中總氰化物EC50為0.18 mg·L-1，5號水樣中總氰化物EC50為0.45 mg·L-1，均<1 mg·L-1，故本案所有廢水水樣的急性毒性類別均為急性類別Ⅰ。

3 討論（Discussion）

筆者研究了密云某私采金礦礦洞中廢水對大型溞的急性毒性，以48 h-EC50作為判定指標，5處水樣按毒性強弱排序為：水樣4、水樣1、水樣2、水樣5和水樣3。根據取樣點位置，3～5號水樣均為廢水池右側區域采取，急性毒性應相近，但結果顯示水樣4毒性差異較大，猜測這是由于廢水長時間放置，經過了沉淀和分層過程，導致毒性物質分布不均勻。

圖3 5個水樣的劑量-效應曲線注：EC50（24 h）指培養24 h的大型溞半數抑制時水樣稀釋倍數；EC50（48 h）指培養48 h的大型溞半數抑制時水樣稀釋倍數。Fig. 3 Dose-effect curve of five samplesNote: EC50（24 h） refers to the dilution ratio of sample when half of Daphnia magna is inhibited after culture for 24 h；EC50（48 h） refers to the dilution ratio of sample when half of Daphnia magna is inhibited after culture for 48 h.

水樣1取自廢水池左側較淺的區域，該位置水面面積大且深度較淺，猜測在長期放置過程中廢水中的水分蒸發較其他區域明顯，因此水樣1毒性略大。

目前關于大型溞急性毒性的研究大多以大型溞的死亡作為評價依據[19-22]，但有研究表明LC50不能有效反映環境中的污染物真實含量和毒性[10]。因此，本研究選擇了活動抑制率和形態行為觀察2個指標，能更直觀更靈敏地反饋水樣的生物急性毒性情況。

本研究實驗方法參考了《化學品 溞類急性活動抑制試驗》（GB/T 21830—2008）和《水質 物質對溞類急性毒性測定方法》（GB/T 13266—91）2個國家標準。雖后者適用范圍中包括工業廢水，但發布日期為1991年，目前尚無更新版本；且5個廢水水樣雖成分復雜，但均為冶金過程中產生的化學物質。因此，研究人員綜合參考了上述2個標準進行研究。

根據本實驗背景案件信息，實驗中的廢水水樣為金礦采礦后的廢液，應為多種物質的混合物，根據工藝推斷其中應含有大量的氰根離子和金屬元素，生物急性毒性應為多種毒性物質的混合效應。最終結果無法單獨使用其中某一種物質的EC50表示，因此采用了稀釋倍數作為替代，表示相對毒性的高低。當大型溞半數抑制時，水樣的稀釋倍數越大，原水樣的生物毒性越大。

在《水質 物質對溞類急性毒性測定方法》（GB/T 13266—91）中，廢水也是經過了與蒸餾水配比后才進行毒性試驗，即同樣對原水樣進行了稀釋。為更加全面地證明本研究中廢水水樣的生物毒性，研究人員對水樣中的主要毒性物質——總氰化物和重金屬進行了檢測，并增加了培養24 h的結果統計。

廢水中的總氰化物和金屬元素定量檢測結果顯示，廢水中除含有較高的總氰化物外，還有含量較高的Ag、Au、Cu、Co、Fe、K、Mg和Zn等主要金屬元素。國內研究較多的為Zn[23-24]、Cu[24]元素對大型溞的影響，陳麗萍等[23]通過實驗得出Cu和Zn對大型溞的48 h-EC50值分別為0.0356 mg·L-1和0.218 mg·L-1。本研究檢測結果中Cu和Zn的含量均明顯高于上述值，因此水樣中除總氰化物外其他金屬也會對大型溞的生存有影響，多種金屬的混合溶液對大型溞的毒性作用與各種金屬各自對大型溞的毒性作用之間的關系尚不明確，有待進一步研究。

在實驗過程中，觀察對照組及重鉻酸鉀組中大型溞的活動情況，對照組中大型溞的活動抑制率<10%，重鉻酸鉀組的24 h-EC50值在0.6～2.1 mg·L-1范圍內，符合規范要求，大型溞對化學品的敏感性能達到實驗要求。實驗前和實驗期間的水質測定結果顯示，溫度變化<1 ℃，溶解氧結果與實驗開始相比無明顯差異，>3 mg·L-1。因此檢測及分析結果有效可信。

本實驗基于真實刑事案例，對于案件中的證據提供有較為嚴苛的時間要求，若采用大型溞的慢性毒性實驗，則會延誤后續的執法與審判。同時，本研究中急性毒性實驗數據已滿足相關委托部門要求，故未開展大型溞的慢性毒性實驗。

綜上所述，本研究從形態行為、活動抑制率2個個體層次對密云私采金礦礦洞中廢水的生物急性毒性進行了檢測。急性毒性實驗結果顯示，5個采樣點采集的水樣均嚴重抑制了大型溞的生存及活動，由此可知，私采金礦的行為會對自然環境產生極其惡劣的影響。因此，應進一步加強對金礦開采后產生廢水的加工和處理并嚴格管控工業廢水的私自排放。