石油烴污染土壤中蚯蚓對PAHs富集研究

黃盼盼，陶宗鑫，王佳佳，徐晶，歐陽少虎,*

1. 東營市生態環境局，東營 257000 2. 南開大學環境科學與工程學院，環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津 300071

石油是當今世界的主要能源之一，被譽為“經濟血液”和“黑色黃金”。人類對于石油需求的不斷增長使得石油烴污染事故頻發，日益受到廣泛關注[1-3]。石油及其產品的生產、運輸和處置等過程中的意外排放是多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）的重要來源，也可以說發生石油污染時往往伴隨著PAHs污染。此外，PAHs是石油烴重要組成部分，雖然僅占到其烴類物質的5%～9%，但因PAHs具有致突變、致癌、致畸和高富集性的特點，導致石油烴的危害絕大多數都是由于PAHs造成的[4-6]。研究表明，石油烴污染土壤往往會伴生PAHs污染[7]，并且PAHs具有親脂性和疏水性易被土壤顆粒吸附積累[8]，還能通過食物鏈在生物體內不斷富集[9-10]。因此，研究石油烴污染脅迫下土壤生物對PAHs富集特征對于土壤生態系統保護、修復和健康評估是很有必要的。

蚯蚓作為土壤污染的重要指示生物，它的生命活動會直接或間接影響PAHs在土壤中的遷移和轉化[11-12]。生物富集系數可以綜合評價污染物在生物體內的富集趨勢[6, 13]，因而分析蚯蚓中PAHs的富集量和生物富集系數，可以間接地反映土壤被石油烴污染的狀況。目前石油烴污染物在海洋生物和土壤生物體內的富集特征研究已有一些報道[14-16]，而關于石油污染伴隨的PAHs污染中不同環數PAHs在蚯蚓體內的富集特征的研究則鮮有報道。因此，本文模擬土壤在不同污染濃度石油烴污染脅迫下蚯蚓對其伴隨的PAHs富集量和富集系數研究，揭示不同環數PAHs在蚯蚓體內的富集規律，該研究成果可為土壤石油烴污染物中PAHs對土壤生物的生態健康評估提供數據支撐。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗材料

試驗所用赤子愛勝蚓（Eiseniafoetida）為國際標準（OECD 207）試驗蚓種之一[17]，購于天津賈立明蚯蚓養殖有限公司。赤子愛勝蚓體長35～70 mm，寬3～5 mm。顏色不定，紫色、紅色、暗紅色或淡紅褐色，有時在背部色素變少的節間區有黃褐色交替的帶。挑選健康的個體，清腸24 h后用作正式實驗測試生物。

16種優先控制的多環芳烴PAHs（萘、苊、二氫苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽、茚并[1,2,3-cd]芘和苯并[g,h,i]苝）標準樣品（初始濃度2 mg·mL-1），購自美國J&K Acros公司。色譜純二氯甲烷和正己烷購買自天津市康科德科技有限公司，中性氧化鋁、層析用硅膠和無水硫酸鈉購買自天津市化學試劑廠。

試驗所用石油污染和清潔表層土壤（0～20 cm）分別采自山東省勝利油田現河采油廠（37°7′N，118°22′E）及其附近無污染的農田。將土壤樣品自然風干，過2 mm篩，測定其pH值為8.3～8.4，石油污染土壤和清潔土壤中有機質含量分別為275.3 g·kg-1和59.0 g·kg-1。

1.2 土壤中總石油烴含量和PAHs含量的測定

采用重量法中的索氏萃取法來測定土壤中總石油烴含量[18]。稱取5.0 g過篩后的石油污染土樣，用濾紙包好后放入索氏提取器中。加入150 mL二氯甲烷，于55 ℃恒溫水浴萃取24 h。萃取結束后，取下圓底燒瓶，55 ℃旋轉蒸發至干，在通風櫥內揮發至恒重，稱量質量。經測定，石油污染土壤中總石油烴的含量為110.0 g·kg-1。將上述石油烴萃取液過硅膠層析柱（12 cm硅膠，6 cm氧化鋁和1 cm無水硫酸鈉填充），加入70 mL正己烷與二氯甲烷1∶1混合液洗脫，此時得到含有PAHs洗脫液。將洗脫液再次旋蒸，待樣品剩余2 mL時停止旋蒸，氮吹儀吹掃至近干。用色譜純的正己烷定容至10 mL，取1 mL于氣相小瓶中，待測，采用氣相色譜質譜聯用法（GC-MS）對石油污染土壤中16種PAHs進行定量分析。

1.3 蚯蚓石油烴污染土壤暴露富集實驗

綜合考慮石油烴在實際污染土壤中的濃度（110.0 g·kg-1）及其對蚯蚓14 d-LC50濃度（21.9 g·kg-1）[3]，將過篩后的石油烴污染土壤與清潔土壤按不同比例充分混合，配制成不同濃度（0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0和20.0 g·kg-1）的石油烴污染土壤用于蚯蚓染毒，暴露試驗按照OECD （2004）推薦的標準方法進行[19]。染毒實驗選用1 L的燒杯，每個燒杯中加入500 g混勻的不同濃度石油烴污染土壤樣品，每個試驗濃度設置3個重復，試驗期間調節土壤含水量為最大持水量的60%。平衡24 h后將土壤攪拌均勻，每個燒杯中放入10條已經清腸的蚯蚓，置于20 ℃的人工氣候培養箱中黑暗避光培養。分別暴露7、14、21和28 d時，從每個燒杯中取出2條蚯蚓，用蒸餾水洗凈、清腸、稱量質量、編號，于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續實驗測定。

1.4 PAHs含量的測定

目前分析PAHs含量的主要方法有高效液相色譜法、紙色譜熒光光度法、氣相色譜法和氣相色譜質譜聯用法等[20]。本文使用GC-MS法對石油污染土壤和蚯蚓樣品體內16種PAHs進行定量分析。

1.4.1 蚯蚓樣品體內PAHs的提取與富集

稱取一定質量冷凍干燥48 h磨成粉末狀的蚯蚓樣品，用濾紙將蚯蚓樣品包好，采用和1.2中完全一樣的索氏提取方法提取和富集蚯蚓體內的PAHs。待富集到蚯蚓樣品中的PAHs萃取液后，經氮吹后用色譜純的正己烷定容至10 mL，取1 mL于氣相小瓶中用GC-MS測定。

1.4.2 GC-MS測定PAHs儀器分析條件

利用GC-MS D5975氣質聯用儀（Agilent，美國）的SIM模式測定土壤和蚯蚓體內的PAHs。色譜條件如下：色譜柱為TR5-MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純度氦氣（99.999%），進樣口溫度為280 ℃，進樣體積為1 μL，無分流自動進樣。柱溫箱升溫程序：初始溫度70 ℃，保持2 min，然后以10 ℃·min-1上升至260 ℃，保持8 min，最后以5 ℃·min-1上升至300 ℃，保持5 min。采用外標法對PAHs進行定量分析，以16種PAHs標準樣品在相同色譜條件下樣品中C10～C35之間所出的色譜峰進行積分，從而獲得定量分析結果。16種PAHs的保留時間及特征離子如表1所示，標準樣品色譜圖如圖1所示。

表1 16種多環芳烴（PAHs）標準樣品的結構參數及GC-MS測定參數Table 1 Structural parameters and GC-MS determination parameters of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） standard samples

圖1 PAHs標準樣品的GC色譜圖Fig. 1 GC diagram of PAHs standard sample

1.5 數據統計和實驗數據分析

對總PAHs在蚯蚓體內的生物富集系數（bio-concentration factors, BCF）進行計算，公式如下：

BCF=Ce/Cm

（1）

式中：Cm為暴露土壤介質中PAHs的濃度（μg·g-1）；Ce為蚯蚓中PAHs富集濃度（μg·g-1）。

所有的實驗組均設置3個實驗組平行，結果用平均值±標準偏差表示，數據作圖用Origin 2021b軟件處理。實驗數據使用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差（ANOVA）分析，P<0.05、P<0.01為顯著性差異。

2 結果與討論（Results and discussion）

2.1 石油烴污染土壤中PAHs的含量及其組分特征

結果表明，石油污染附近農田表層清潔土壤中16種PAHs總含量為0.56 μg·kg-1，而石油烴污染表層土壤中16種PAHs總含量高達20 070 μg·kg-1。根據Maliszewska-Kordybach[21]提出的土壤PAHs污染評價標準，可將土壤中PAHs的殘留濃度分為4個等級：未污染（<200 μg·kg-1）、輕度污染（200～600 μg·kg-1）、中度污染（600～1 000 μg·kg-1）和嚴重污染（>1 000 μg·kg-1）。本研究區表層清潔土壤屬于未污染土壤，而石油污染土壤中PAHs的平均含量超過嚴重污染標準20倍，說明該地區土壤已受到PAHs超級嚴重污染。此外，與國內外其他地區PAHs污染嚴重土壤相比，如中國安徽蕪湖市交通區土壤PAHs含量（5 030 μg·kg-1）、俄羅斯莫斯科國家公園交通區土壤（264 030 μg·kg-1）和印度尼西亞南加里曼丹煤炭儲存地土壤（11 720 μg·kg-1）[22-24]，本研究污染土壤中PAHs含量都明顯偏高。根據以上結果分析，可以充分表明本地區人類石油烴開采活動對土壤PAHs超高水平污染的影響，因此急需開展PAHs治理與毒性評估工作。

土壤中PAHs環數的組成可反映其組分特征，同時也代表其不同的污染來源，在后期PAHs源解析中起著至關重要的基礎數據支撐作用[25]。因此，根據16種PAHs環數組成可以將其分為2環（萘、苊、二氫苊和芴）、3環（菲、蒽和熒蒽）、4環（芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]熒蒽和苯并[k]熒蒽）、5環（苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽和茚并[1,2,3-cd]芘）和6環（苯并[g,h,i]苝）PAHs，其相應的結構式如表2所示。由表2可知，本研究石油烴污染土壤中2個苯環的PAHs含量為3.43 μg·g-1，3個苯環的PAHs含量為12.13 μg·g-1，4個苯環的PAHs含量為3.80 μg·g-1，5個苯環和6個苯環的PAHs含量分別為0.41 μg·g-1和0.30 μg·g-1。PAHs環數占比依次為3環（60.44%）>4環（18.93%）>2環（17.10%）>5環（2.04%）>6環（1.49%）。由此可見，石油烴PAHs污染土壤中3環和4環PAHs占有較大比例（>79%），這與國內其他PAHs污染地區的組分特征研究結果保持一致[26-27]。石油烴污染土壤中含量最高的是菲，達到11.21 μg·g-1，其次>1.00 μg·g-1的依次是芴1.58 μg·g-1，屈1.27 μg·g-1，芘1.22 μg·g-1，萘1.1533 μg·g-1。

表2 石油烴污染土壤中16種PAHs的GC-MS測定參數及結果Table 2 Determination parameters and results of 16 PAHs in petroleum hydrocarbon contaminated soil by GC-MS

2.2 無石油烴污染脅迫時總PAHs及各環PAHs在蚯蚓體內的富集變化

據報道，不同環數的PAHs在蚯蚓體內的富集量是不同的[28-29]。如圖2所示，在無石油烴污染暴露時，16種PAHs在蚯蚓體內也有不同程度的積累，達0.21 μg·g-1。而且，在暴露7 d與暴露14～28 d相比，總PAHs和各環PAHs在蚯蚓的體內富集濃度沒有顯著性差異（P<0.05），說明在7 d內蚯蚓對PAHs的富集已達到平衡。此外，暴露7 d時，蚯蚓對不同環數PAHs的富集量排序為：2環PAHs（0.11 μg·g-1）>5環PAHs（0.05 μg·g-1）>4環PAHs（0.03 μg·g-1）>3環PAHs（0.02 μg·g-1）>6環PAHs（0.01 μg·g-1），本研究結果也證實了不同環數的PAHs在蚯蚓體內的富集量確實有差異。此外，如表3所示，暴露28 d時，蚯蚓對不同環數PAHs的生物富集系數排序為：5環PAHs（0.58）>4環PAHs（0.46）>3環PAHs（0.44）>2環PAHs（0.32）>6環PAHs（0.24）。這表明，除了2環PAHs外，蚯蚓對其他多環PAHs富集量與富集系數保持一致的規律。

2.3 石油烴污染脅迫下伴隨的總PAHs及各環PAHs在蚯蚓體內的富集變化

圖2 未污染土壤中總PAHs及各環PAHs在蚯蚓體內的富集量Fig. 2 Enrichment of total PAHs and various cyclic PAHs in uncontaminated soil by earthworms

表3 不同暴露時間、暴露濃度下總PAHs及各環PAHs在蚯蚓體內的生物富集系數（BCFs）Table 3 Bio-concentration factors （BCFs） of total PAHs and various cyclic PAHs at different exposure duration and concentration in earthworms

在石油烴脅迫污染下7～28 d后，總PAHs及各環PAHs在蚯蚓體內的富集量如圖3所示。總體而言，與無石油烴脅迫土壤相比（圖2），石油烴污染土壤蚯蚓體內總PAHs（圖3（a））和各環PAHs（圖3（b）～3（f））的富集量都顯著（P<0.05）提高，且隨石油烴染毒濃度和暴露時間增加而提高。這說明蚯蚓在石油烴暴露下體內蓄積的PAHs主要來源是石油烴中PAHs。通常，PAHs在蚯蚓體內的富集與土壤中的PAHs濃度及組成有著極大的關系，因而有必要進一步考察石油烴脅迫下其伴隨的PAHs含量。如表3所示，測得石油烴污染土壤中16種PAHs總含量為20.07 μg·g-1，石油烴含量為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0和20.0 g·kg-1的土壤中PAHs的總含量依次為0.09、0.18、0.46、0.91、1.82和3.65 μg·g-1。特別是在高濃度（20 g·kg-1）暴露下這一規律顯得尤為顯著。例如，在20 g·kg-1石油烴污染土壤中，總PAHs在蚯蚓7、14、21和28 d富集量分別為3.55、4.59、5.57和7.05 μg·g-1，28 d富集量是7 d富集量的1.99倍，差異顯著（P<0.01）。同樣的趨勢還出現蚯蚓對3環、4環、5環和6環PAHs的體內富集中（圖3（c）～3（f））。結果表明，在相同的石油烴暴露濃度下，蚯蚓對PAHs的2環、3環和4環富集量顯著（P<0.05）大于5環和6環富集量，并且土壤中石油烴暴露濃度越大，這種富集效果越明顯。以上結果說明，蚯蚓對各環PAHs的富集量受到PAHs暴露濃度和暴露時間的影響。蚯蚓對PAHs的富集平衡時間與石油烴暴露的濃度存在一定關聯，當無石油烴暴露時，蚯蚓在7 d內即可達到富集平衡，而當高濃度石油烴暴露時，蚯蚓對石油烴污染土壤伴隨的PAHs的富集平衡時間延長了，14～28 d內都未達到富集平衡。隨著石油烴暴露時間的增大（如28 d時），蚯蚓對PAHs的富集速率隨其環數的增加而降低，這可能是由于PAHs進入土壤后與土壤中活性物質如有機質發生相互作用而引起的老化過程導致的，有研究表明PAHs在不同的老化時間，蚯蚓對低環數PAHs的吸收率和BCF都大于高環數PAHs（表3），表明高環數PAHs的生物有效性小于低環數PAHs[30]。污染物起始暴露濃度對生物的富集有很大影響[6, 31]，本研究土壤中的2環PAHs、3環PAHs以及4環PAHs的初始暴露含量遠高于5環和6環PAHs（表3），這可能是造成上述趨勢的原因之一。此外，PAHs的辛醇水分配系數（Kow）也是影響PAHs生物有效性的關鍵因素之一，PAHs的環數不同，其辛醇水分配系數也不相同，低環數（2～4環）PAHs的辛醇-水分配系數（如萘，logKow=3.4）小于高環數（5～6環）PAHs（如苯并[a]芘，logKow=6.3），所以低環數（2～4環）PAHs更容易進入土壤空隙水中，從而容易被蚯蚓以被動擴散的方式吸收，而辛醇-水分配系數較高的高環PAHs（5～6環）則容易被土壤顆粒中黏粒組分吸附并結合，從而使得蚯蚓表現出較低的生物有效性，研究表明那些溶解于水相或者弱吸附狀態的低環數（2～4環）PAHs（如萘）才更可能通過表皮或者腸道吸收的方式進入蚯蚓體內，從而增加其在蚯蚓體內富集[32-33]。Cuypers等[34]的研究表明當PAHs的環數從2環增加到6環時，PAHs分子直徑相應地從0.5 nm增加到0.9 nm，而高環數大粒徑的PAHs相對于低環數小粒徑的PAHs更難以進入生物體內并在其體內積累。

通過公式（1）計算不同暴露時間和石油烴暴露濃度下伴隨的PAHs在蚯蚓體內的BCF，結果如表3所示。結果表明，在6種不同濃度石油烴污染的土壤中，不同培養時間對蚯蚓體內總PAHs及各環PAHs富集量的影響均表現出顯著性（P<0.05）差異（如對于1 g·kg-1石油烴污染的土壤，7 d總PAHs BCF為23.58；對于2.5 g·kg-1石油烴污染的土壤，28 d 5環PAHs BCF=106.03；對于20.0 g·kg-1石油烴污染的土壤，21 d 2環PAHs BCF為5.19）。除了3環PAHs在7～21 d時BCF<1外，其他所有石油烴的處理組中BCF都>1，說明蚯蚓可以較好地富集PAHs。在同一濃度石油烴暴露下，隨著染毒時間的增加，蚯蚓體內總PAHs及各環PAHs的BCF總體呈增大趨勢，這可能因為PAHs在蚯蚓體內的富集，而使土壤中的含量降低，使得BCF增大。對同一暴露時間而言，隨著石油烴染毒濃度的增加，蚯蚓體內總PAHs及各環PAHs的BCF呈現先增大后減小的趨勢，這主要是因為當石油烴染毒濃度較低時，蚯蚓對其適應性較強，可以較好地對PAHs進行富集，并且富集量很快達到閾值，使得蚯蚓PAHs中毒或者抗氧化酶活性降低，從而對PAHs的富集量保持不變或者下降，導致BCF呈下降趨勢[6, 35]。通過對比不同環數PAHs的BCF發現，在1 g·kg-1石油烴污染的土壤暴露28 d后5環PAHs的BCF最大（191.03），表明蚯蚓可以很好地富集5環PAHs。

2.4 石油烴暴露濃度與蚯蚓體內PAHs生物富集特征相關性分析

已有研究表明，經過11 d，不同濃度石油烴污染物在污染土壤和蚯蚓之間均達到了動態分配穩態平衡[36]，所以在富集的第28天，蚯蚓對土壤中的石油烴的PAHs富集已達到平衡，基本上不再隨時間變化而發生顯著變化。因此，為了進一步深入揭示石油烴污染對蚯蚓PAHs生物富集特征的影響，對28 d石油烴污染后暴露濃度與蚯蚓PAHs富集量及BCF的相關性進行了分析，結果如圖4所示。由圖4（a）和4（b）可知，石油烴暴露濃度與蚯蚓體內總PAHs和各環PAHs富集量的關系呈良好的正線性關系。經過28 d的富集，不同石油烴暴露濃度與總PAHs、2環PAHs、3環PAHs、4環PAHs、5環PAHs和6環PAHs的相關系數（r2）分別為0.93、0.93、0.96、0.84、0.64和0.83。以上結果說明石油烴暴露濃度和蚯蚓體內總PAHs富集量之間存在著正相關關系，而且PAHs環數越低，整體的正向相關性越好。此外，在同一暴露時間28 d下，線性擬合的斜率（K）值越大，說明富集速率越大。由此可知，蚯蚓對不同環數PAHs的富集速率大小依次為：2環PAHs（K=0.059）>3環PAHs（K=0.059）>4環PAHs（K=0.049）>5環PAHs（K=0.0064）>6環PAHs（K=0.0039）。這說明蚯蚓在石油烴脅迫28 d后對PAHs的吸收速率隨其環數的增加而降低。

圖3 石油烴脅迫污染下總PAHs及各環PAHs在蚯蚓體內的富集量Fig. 3 Accumulation of total PAHs and cyclic PAHs in earthworms under petroleum hydrocarbon stress

暴露28 d后，不同石油烴濃度與蚯蚓體內總PAHs和各環PAHs的BCF線性相關關系如圖4（c）～4（d）所示。在低濃度（0.5 g·kg-1和1 g·kg-1）石油烴暴露下，蚯蚓對總PAHs與各環（除6環）PAHs的BCF呈顯著的正相關，隨著石油烴暴露濃度增加，BCF值逐漸增大。在1 g·kg-1石油烴暴露下，蚯蚓對總PAHs、2環PAHs、3環PAHs、4環PAHs和5環PAHs的BCF都達到最大值，分別為28.78、52.19、16.25、43.53和191.03（表3和圖3（c）～3（d））。與之相反的是在高濃度石油烴暴露（2.5～20 g·kg-1）下，暴露濃度與BCF之間的關系呈現負線性相關關系，隨著暴露濃度的增大，總PAHs和各環PAHs的BCF值呈不斷減小趨勢。而且，當暴露石油烴濃度>10 g·kg-1，蚯蚓對總PAHs和各環PAHs的BCF趨向緩慢降低至無明顯變化。以上結果表明，隨著石油烴暴露濃度的增加，在石油烴脅迫下蚯蚓對各環PAHs的富集水平具有一定的選擇性，且隨著高濃度石油烴暴露的濃度增加，蚯蚓對總PAHs和各環PAHs的富集能力也下降。此外，對比富集量和BCF與暴露濃度之間的關系（圖4），還發現蚯蚓對總PAHs和各環PAHs的富集量與BCF的線性相關性不大，這與之前其他研究報道的結論類似[37]。

綜上，本實驗通過對蚯蚓在不同濃度石油烴（0～20 g·kg-1）和暴露時間（7～28 d）下對PAHs在體內的富集量和BCF進行分析，得出蚯蚓對于PAHs具有很強的富集效應，且對不同環數PAHs具有較好的選擇性富集能力，因而，蚯蚓能夠成為研究采油區土壤PAHs污染的指示生物。

綜上可知，本研究表明：（1）蚯蚓能從石油烴污染土壤中吸收PAHs，與無石油烴污染空白對照組相比，蚯蚓對總PAHs和各環PAHs的富集作用有顯著提升。（2）通過對蚯蚓對總PAHs和各環PAHs富集量研究發現，隨著石油烴暴露濃度和暴露時間不斷增加，蚯蚓對其中伴隨的總PAHs和各環PAHs的富集量也顯著性增加。此外，蚯蚓對不同環數PAHs具有明顯的選擇性富集特征，相比于高環數（5～6環）PAHs，低環數（2～4）PAHs更容易被蚯蚓富集。而且暴露28 d后，蚯蚓對PAHs的富集速率隨其環數的增加而降低。（3）通過對蚯蚓對總PAHs和各環PAHs的BCF研究發現，在同一濃度石油烴暴露下，隨著染毒時間的增加，BCF值增大；對同一暴露時間而言，BCF的值隨著石油烴染毒濃度的增加呈現先增大后減小的趨勢。然而，蚯蚓對總PAHs和各環PAHs的BCF與其富集量之間沒有特別明顯的線性相關關系，未來研究中，有關富集量和富集系數的關系有待進一步研究。

圖4 總PAHs及各環PAHs在蚯蚓體內的富集量和BCF與石油烴濃度的相關性分析Fig. 4 The correlation analysis between petroleum hydrocarbon concentration and the enrichment and BCFs of total PAHs and various cyclic PAHs in earthworms