三角褐指藻對環丙沙星的去除過程及影響因素

姜現靜，呂劍,*，武君，王建華，張翠

1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所，中國科學院海岸帶環境過程與生態修復重點實驗室，煙臺 264003 2. 山東省海岸帶環境過程重點實驗室，煙臺 264003 3. 中國科學院大學，北京 100049 4. 煙臺哈爾濱工程大學研究院，煙臺 264006

隨著沿海地區生產生活活動日益加劇，大量污染物持續輸入海岸帶，生態環境面臨著嚴重威脅[1]。近年來，包括抗生素在內的新污染物備受關注[2]。在我國約1.8萬km的海岸線上采取水樣，可以檢測出7種目標抗生素，總濃度為389～3 302.3 ng·L-1，其中諾氟沙星、羅紅霉素和環丙沙星最為常見[3]。并且我國沿海水體及沉積物中多數抗生素的濃度明顯高于其他國家和地區[1]。大多數抗生素因具有一定的疏水性和親脂性不容易被降解[4]，從而在環境中持續積累，氟喹諾酮類抗生素在環境中就表現出較強的持久性[5]。雖然水體中抗生素的濃度一般介于ng·L-1～μg·L-1[6]，但是細菌長期暴露于低濃度抗生素環境中可以產生耐藥性，進一步導致抗生素抗性基因的傳播，隨著食物鏈傳遞將對生態系統平衡與人類身體健康帶來很大風險。

微藻位于生物鏈底端，生物量巨大，在淡水、河口、海洋，乃至陸地環境中均有分布[7-8]。微藻因為細胞體積小，比表面積大，受光面積大，所以與高等植物相比具有更高的光合效率。其生物質可用于生產生物燃料、動物飼料、保健品和化妝品等高價值產品[7]。在綠色經濟可持續發展的大背景下，微藻在污水處理中的應用也越來越受關注。微藻能夠攝取氮磷營養鹽、光合放氧緩解富營養化，在污泥表面形成微藻生物膜防止污泥解體加劇水質惡化，甚至還會減少致病菌的數量[9]。混合營養型微藻在無光環境中以有機碳為碳源能夠緩解弱光條件下深色污水光供應不足的問題，并且生長周期短、生物質產量高[10]。將微藻與抗生素的生物降解過程有機結合起來，為生物質的資源化利用和水體中污染物同步有效去除提供了新思路。目前，在利用微藻處理抗生素廢水方面已經開展了一些研究。例如，用小球藻去除左氧氟沙星[11]、氟苯尼考[12]、阿莫西林[8]或混合抗生素[13]，用衣藻去除環丙沙星[14-15]等。微藻對抗生素廢水的凈化效果受微藻種類、環境條件和抗生素濃度等多種因素的影響。已有研究多以淡水系統作為研究對象，而海洋環境較淡水環境更為復雜，微藻應用于海水抗生素污染治理的潛力有待探索。

三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）是典型的硅藻，富含油脂[16]，可利用多種有機物作為碳源進行混合營養生長[17]。它也是海洋生態系統中非常重要的初級生產者，可作為水產養殖的優良餌料[17]。然而，常見抗生素對綠藻的研究最多，對硅藻的研究較少[18]。因此，本文選三角褐指藻作為模型微藻。氟喹諾酮類抗生素被廣泛用于畜禽養殖業，其中諾氟沙星、環丙沙星（ciprofloxacin, CIP）和氧氟沙星在多種環境介質中均處于相對較高的濃度水平[18-19]。而CIP的殺菌效果高于諾氟沙星[20]，在環境中的行為更值得關注。所以，本文以CIP為目標污染物，研究了三角褐指藻對CIP的去除動力學規律。并進一步探究了pH、光照、鹽度和抗生素初始濃度等因素對去除效率的影響，為微藻在海洋抗生素污染治理領域的應用提供有價值的參考。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗材料和儀器

實驗所用藻種為實驗室儲備的三角褐指藻。所用海水來自煙臺市向海延伸100 m處水域（pH～8.5，鹽度～30‰）。CIP（純度98%）購自上海麥克林生化科技有限公司，其他所有試劑均為分析純。主要儀器為智能光照培養箱（GXA-380B，寧波江南儀器廠，中國）、超高效液相色譜儀（UPLC）（ACQUITY UPLC H-Class，沃特世科技有限公司，美國）和紫外可見分光光度計（TU-1810PC，北京普析通用儀器有限責任公司，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CIP母液配制方法

準確稱取0.010 g CIP，加入0.1 mL過濾除菌的1 mol·L-1HCl溶液，加入甲醇溶解并定容至10 mL獲得1 g·L-1CIP母液，4 ℃密封于棕色瓶保存。用0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾后的培養基配制CIP標準溶液供定量檢測使用。

1.2.2 培養基制備及微藻培養

實驗所用微藻需每個月進行一次傳代培養以維持活力。用0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾后的海水，根據Guillard[21]提供的方法配制f/2培養基，121 ℃、高溫濕熱滅菌20 min，自然冷卻至室溫后，繼續添加過濾除菌的維生素貯備液和Na2SiO3貯備液，充分混勻備用。在超凈臺中以10%的接種量（藻液和培養基的體積比）將藻種接種到培養基中，放置于光照培養箱中培養。光照培養箱參數設置為光照度33%，光暗周期L∶D=14 h∶10 h，溫度20 ℃。每天定時搖瓶3次，防止微藻細胞沉底或貼壁，并保證體系中氧氣和二氧化碳的交換。

1.2.3 微藻細胞干質量（DCW）與光密度（OD680）相關關系的測定

微藻培養到生長穩定期時（約40 d），將藻液靜置1 d后用移液槍吸取細胞沉淀，取適量f/2培養基將藻液稀釋成不同濃度，控制OD680在0.1～1.5。取0.45 μm玻璃纖維濾膜于105 ℃烘干24 h，干燥器內冷卻至室溫后稱量質量。取一定體積稀釋后的藻液過濾，再用10 mL 0.5 mol·L-1NH4HCO3溶液分2次洗滌藻細胞。用鑷子收取濾膜，于95 ℃烘干24 h，干燥器內冷卻至室溫后稱量質量。根據公式計算細胞干質量，繪制OD680-DCW標準曲線。

式中：DCW指單位體積細胞干質量（g·L-1）；m0指過濾前干燥濾膜的質量（g）；m指過濾后干燥濾膜和藻細胞的總質量（g）；V指稀釋后所取藻液的體積（mL）。

1.2.4 抗生素去除過程的動力學模型擬合

在250 mL三角瓶內加入150 mL培養基，再加入90 μL CIP母液（1 g·L-1），使抗生素初始濃度約為600 μg·L-1。微藻接種量為1%（OD680～1）。培養條件同1.2.1，定時搖瓶3 次·d-1。設置無微藻和微藻121 ℃滅活2個對照組。接種第0～90天間隔取樣，將藻液搖勻后取1 mL，12 000 r·min-1離心12 min，取0.8 mL上清液測培養基中殘留的CIP濃度；取3 mL藻液測OD680。所用器皿均經過滅菌處理，取樣全程無菌操作。

分別用一級動力學和二級動力學模型對三角褐指藻去除CIP的過程進行擬合：

式中：c0和ct分別指培養物中CIP的初始濃度和t時刻的濃度（μg·L-1），k1和k2分別指一級動力學和二級動力學降解速率常數（d-1）。

1.2.5 三角褐指藻去除抗生素影響實驗

探究pH影響時，f/2培養基滅菌前用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH調節pH為5.5、6.5、7.5、8.5和9.5。設置無微藻和無抗生素2個對照組，其他條件同1.2.3。

探究鹽度影響時，海水過濾后先用蒸餾水調節鹽度為10‰、20‰和30‰，再用于配制培養基。設置無微藻和無抗生素2個對照組，其他條件同1.2.3。

探究光照強度影響時，根據光照培養箱參數設置光照強度為0、33%、66%和100%。其中光照度為0的實驗組用鋁箔紙避光作暗處理。設置無微藻和無抗生素2個對照組，其他條件同1.2.3。

探究抗生素初始濃度影響時，向150 mL培養基中分別加入15、30、60、90、120和150 μL CIP母液（1 g·L-1），使抗生素初始濃度約為100、200、400、600、800和1 000 μg·L-1。設置無抗生素對照組，其他條件同1.2.3。經預實驗表明，CIP母液中HCl和甲醇對三角褐指藻生長的影響可以忽略。

1.2.6 CIP定量檢測

用UPLC檢測CIP濃度。UPLC配備C18反相色譜柱，檢測器為熒光檢測器，進樣量2 μL，柱溫40 ℃，流動相為0.01 mol·L-1磷草酸/乙腈/甲醇（80/10/10，V∶V），流速0.3 mL·min-1，激發和發射波長分別為280 nm和450 nm，保留時間約為1.7 min。

1.2.7 數據分析

所有實驗均做3組平行。采用單因素方差分析（ANOVA）確定主效應的顯著性，用Tukey’s test確定水平之間是否具有顯著差異。對于所有的統計分析，α值為0.05，P<0.05被認為是顯著的概率。所有數據分析和繪圖均使用OriginPro 2021完成。

2 結果（Results）

2.1 抗生素去除過程的動力學模型擬合

如圖1（a）所示，在整個實驗過程中，無微藻對照組（CK1）和微藻滅活對照組（CK2）中CIP的濃度變化趨勢一致，說明剛接種的微藻細胞對CIP的吸附作用可忽略不計。對照組中CIP去除率均在5%～15%范圍內波動，證明包括水解、光解在內的非生物作用甚微，可見CIP在海水中具有持久性。接種三角褐指藻55 d后，CIP的去除效率逐漸趨于平緩，最終去除率達（60.0±0.94）%。對該過程進行一級和二級動力學模型擬合，擬合參數如表1所示。數據顯示，該過程更符合一級動力學模型，半衰期47 d。

因為三角褐指藻的OD680與DCW具有良好的線性相關關系（DCW=0.66586×OD680-0.03154，R2=0.97），所以可以用OD680監測微藻的生長情況。從微藻OD680隨時間的變化曲線（圖1（b））看，接種41 d后，三角褐指藻進入生長穩定期。三角褐指藻受到CIP長時間的脅迫，仍然保持良好的生長態勢，對CIP具有較強的耐受性和去除能力。

2.2 pH影響實驗

如圖2（a）所示，在不同pH體系中，三角褐指藻對CIP的去除趨勢大致相同。pH為5.5時，接種微藻6 d后即有（46.0±3.63）%的CIP被去除。pH為6.5～8.5時，CIP的去除率無明顯差別。pH為9.5時，去除率最低（62.4±4.11）%。由圖2（b）可知，pH在6.5～9.5之間，三角褐指藻的生長對數期隨pH升高而縮短，弱堿性培養基中微藻生長速度更快。pH為5.5時生長周期最長且生物量最高；pH為9.5時生長周期最短且生物量最低，30 d時藻液顏色逐漸變淺。但pH為5.5和9.5時，CIP對三角褐指藻均表現出生長抑制作用，OD680分別降低了（13.0±3.03）%和（18.2±3.85）%。

2.3 鹽度影響實驗

圖1 三角褐指藻對環丙沙星（CIP）的去除率（a）和OD680（b）變化注：CK1為無微藻；CK2為微藻滅活。Fig. 1 Removal rate of ciprofloxacin （CIP） （a） and OD680（b） of P. tricornutumNote: CK1 represents group without microalgae; CK2 represents group with microalgae inactivated.

表1 三角褐指藻去除CIP的動力學參數Table 1 Kinetic parameters of CIP dissipation by P. tricornutum

圖2 pH對CIP去除率（a）和三角褐指藻OD680（b）的影響注：CK1為無微藻；CK2為微藻滅活。Fig. 2 Effects of pH on removal rate of CIP （a） and OD680 of P. tricornutum （b）Note: CK1 represents group without microalgae; CK2 represents group with microalgae inactivated.

圖3 鹽度對CIP去除率（a）和三角褐指藻OD680（b）的影響注：CK1為無微藻；CK2為微藻滅活。Fig. 3 Effects of salinity on removal rate of CIP （a） and OD680 of P. tricornutum （b）Note: CK1 represents group without microalgae; CK2 represents group with microalgae inactivated.

如圖3（a）所示，接種三角褐指藻23 d后，CIP的去除效果與鹽度呈負相關，最終10‰、20‰和30‰鹽度下去除率分別為（95.1±0.84）%、（83.8±0.56）%和（67.4±0.29）%。然而，在不含微藻的空白組中CIP的濃度并沒有顯著變化，說明鹽度主要通過影響微藻的生物作用改變CIP的環境行為。由圖3（b）可知三角褐指藻在不同鹽度條件下的生長情況，其中20‰和30‰鹽度下的生長趨勢相似，實驗組接種第40天后30‰的生長量更高一些；10‰鹽度下，實驗組生長量以第30天為節點急劇降低，50 d后趨于平緩，穩定在0.5以下。3種鹽度水平下，空白組三角褐指藻的生長量均高于實驗組，而且空白組都呈現出先增后減的趨勢，其中10‰鹽度的OD680最低（P<0.05）。因而得知，低鹽度不利于三角褐指藻生長。在本實驗中30‰鹽度時，在CIP作用下，三角褐指藻長勢迅速惡化。實驗進行30 d后，10‰鹽度實驗組的藻液由澄清透明變成乳白色渾濁，可能為細胞破碎胞內物質溶出所致。

2.4 光照強度影響實驗

培養箱設置的光照強度33%、66%和100%分別大致對應3 000、4 000和7 000 lx。無微藻空白對照組CIP的去除率隨光照強度的增加略有增加，光解去除率最高不足5%（圖4（a））。在含微藻的處理組中，低光照強度（33%）對CIP的去除率最高為（65.4±0.85）%，中、高光照強度66%和100%去除率分別為（56.0±0.48）%和（56.6±1.66）%。可見，增大光照強度并不會促進三角褐指藻對CIP的降解過程。弱光條件下，CIP對藻細胞生長的抑制作用最明顯（圖4（b））。不存在CIP時，弱光條件下OD680最高，中等光照強度次之，可能高光照強度抑制了光合作用。暗處理組用鋁箔紙完全包裹瓶體，鋁箔紙會因為培養基海水蒸發被腐蝕，發現透光后及時更換。所以，暗處理組的微藻緩慢增殖以及CIP的去除率逐漸升高是不可避免的。

2.5 抗生素初始濃度影響實驗

三角褐指藻對CIP的去除率（52.7±0.84）%～（71.8±2.05）%隨CIP初始濃度的升高而降低（圖5（a））。接種微藻10 d，100 μg·L-1CIP的去除效率比1 000 μg·L-1高3.2倍。至90 d時，高濃度CIP的去除仍未達到平衡。由圖5（b）得知，抗生素處理組的生物量均低于空白對照組，不同濃度的CIP對微藻的生長都有抑制作用，OD680降低了（13.1±6.94）%～（19.1±5.52）%。

3 討論（Discussion）

本文從海水養殖餌料微藻降解處理抗生素的角度，考察了三角褐指藻對CIP的去除過程和不同因素的影響。在不含微藻的空白對照組中CIP去除率非常低，非生物作用有限[14,22]。這可能由于CIP具有疏水特性[15]，水解作用甚微。然而，有研究者認為CIP對光敏感，在水環境中半衰期較短，主要靠光解作用被去除[23]。例如，自然光照72 h鹽酸環丙沙星在自來水中約去除80%[24]；在不含藻的反應液中CIP經紫外照射2 h后的降解率為46.58%[25]。本實驗所得現象與前述研究結果有較大差別，可能是因為前者研究的是淡水系統，而本實驗是以海水培養基為環境介質。大多數抗生素分子都含有羧基、羥基或氨基等可電離的基團，在水溶液中不同解離形式的有機污染物理化性質和毒性取決于污染物所處的水環境介質的組成[26]。因此，CIP在海水中的環境化學行為可能不同于淡水系統。顯然，微藻的生物作用對去除CIP做出了重要貢獻。三角褐指藻對CIP的去除過程符合一級動力學模型，同大多數微藻去除抗生素的規律一致[11,14,27]。但是，三角褐指藻并不能快速去除CIP。因此，本文繼續探究了pH、光照強度、鹽度和抗生素濃度的影響規律。

圖4 光照強度對CIP去除率（a）和三角褐指藻OD680（b）的影響注：CK1為無微藻；CK2為微藻滅活。Fig. 4 Effects of light intensity on removal rate of CIP （a） and OD680 of P. tricornutum （b）Note: CK1 represents group without microalgae; CK2 represents group with microalgae inactivated.

圖5 抗生素初始濃度對CIP去除率（a）和三角褐指藻OD680（b）的影響Fig. 5 Effects of initial antibiotic concentration on removal rate of CIP （a） and OD680 of P. tricornutum （b）

藻類生長體系的pH可介導某些離子抗生素的水解[28]。大多數抗生素具有酸性和/或堿性，其電離狀態受溶液pH和酸性解離常數（pKa）控制[29]。CIP含有多個可電離基團，存在4個pKa值：3.0、6.1、8.7和10.6[29]。羧基在pH>6.1時開始解離，氮原子在pH<8.7時開始質子化[23]。在pH為6.5、7.5和8.5時，CIP主要以H2CIP+的形式存在[23]。有研究認為CIP處于兩性離子狀態最容易發生光解，而在pH為3.0～4.0的溶液中穩定性增加[30-31]。本實驗之所以得到不同的結果，可能是因為在pH為6.5～8.5范圍內，CIP同時帶正電荷和負電荷，削弱了其對微藻細胞的吸附親和性[23]。而生物過程發揮著主導作用，即使堿性環境利于非生物降解，但無法決定CIP最終的歸趨。微藻細胞表面具有呈電負性官能團[32]，pH值越低，CIP質子化程度越高，越容易被微藻細胞吸附，進一步加速了CIP的生物降解過程。此外，pH變化對三角褐指藻的生長有著顯著影響。據報道，三角褐指藻在低pH環境中，生長速率提高5.2%[33]；當pH超過9.0時，比生長速率下降[34]。由此可見，高堿度超出微藻耐受范圍后會抑制其生長，弱酸性環境更有利于三角褐指藻降解去除CIP。

鹽度脅迫下形成的滲透壓會影響微藻細胞對脂質、碳水化合物和蛋白質的合成和積累，改變微藻的生理生化特性以及生長規律[11]。本實驗結果證明低鹽度不利于三角褐指藻生長。相似的，葉麗等[35]發現，三角褐指藻誘變株MP-2在10‰鹽度條件下的生物量明顯低于20‰和30‰鹽度條件下的生物量。低鹽度處理組卻得到了最高的CIP的去除率。這可能是因為溶液中的Na+能夠與藻細胞表面的羥基結合[11]，低鹽環境中Na+和CIP之間的競爭吸附作用減弱，從而促進了下一步生物吸收和降解過程的進行。天然海水的鹽度一般在30‰右左，根據本實驗結果，自然海洋環境不利于三角褐指藻去除CIP。

在光照影響實驗中，含抗生素的處理組中，三角褐指藻OD680隨光照強度的變化關系為66%>100%>33%。類似的，研究發現隨著光照強度的增加，三角褐指藻誘變株MP-2的生物量先增加后降低[35]?？股靥幚斫M和空白對照組在不同光照強度下的OD680均相差僅0.1左右，體現了三角褐指藻具有較強的光適應機制。據報道，三角褐指藻在光限制條件下可以通過增加葉綠素含量提高光合效率，在廣泛光照范圍內比生長速率變化不大[36-37]，即使光照強度超過光飽和點后，也不會出現明顯的光抑制現象[38]?？赡芤驗槿豕鈼l件下三角褐指藻的光合作用更強，誘導產生更多的活性氧，所以CIP去除率更高。在空白對照組中，33%光照下生物量最高，與處理組對比可看出弱光條件下CIP對三角褐指藻的生長抑制作用最強。

CIP去除率與初始濃度呈負相關關系，但最低濃度在90 d內也沒有完全去除，再次驗證了CIP的持久性特點。CIP對多種微藻都表現出毒性效應。Xiong等[14]發現CIP濃度增大會顯著抑制衣藻C.mexicana的生長。連鵬等[39]發現高濃度的鹽酸環丙沙星對亞心形扁藻的生長有明顯的抑制作用，且呈現出濃度-效應關系。劉濱揚[40]發現CIP對羊角月牙藻的生長速率、葉綠素合成、光合系統等生長和生理代謝均有抑制作用。低于1 mg·L-1的CIP對三角褐指藻都表現出生長抑制作用，但生長趨勢一致，反映了三角褐指藻對CIP具有較強的耐受能力。

在影響因素實驗中，經常檢測到無微藻的空白對照組CIP濃度高于初始值，可能是儀器狀態產生的系統誤差所致，并未對其他處理組CIP濃度的變化趨勢產生明顯影響。綜合pH、鹽度、光照和抗生素濃度4個因素對三角褐指藻去除CIP的影響，在改變鹽度時，CIP去除率變化幅度最大，且在10‰鹽度條件下獲得最大去除率為（95.1±0.84）%。由此可見，鹽度影響最顯著。

根據本文研究，三角褐指藻在弱酸、低鹽和弱光環境中才能更高效地去除微濃度CIP。而自然海水呈弱堿性且鹽度高，為CIP在海水中穩定存在創造了條件。因此，需要繼續探究CIP對三角褐指藻的生長抑制作用，提高三角褐指藻的耐受性和降解能力，探索更高效的CIP生物降解方法。