從HBV cccDNA角度談乙型肝炎的功能性治愈

陳 娟， 黃愛龍

重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室， 重慶 400016

HBV感染是我國最為重要的公共衛生問題之一，雖然我國乙型肝炎流行程度大大降低，但是現存感染者和患者數量依然龐大。現有乙型肝炎治療藥物僅能使極少慢性乙型肝炎(CHB)患者達成功能性治愈，即使最有效的組合療法，HBsAg年陰轉率也難以超過2%。實現CHB治愈的關鍵，在于有效抑制或清除HBV在細胞內形成的高穩定性遺傳物——微染色體樣共價閉合環狀DNA(cccDNA)[1]。

現階段正在研發的抗病毒藥物包括病毒進入抑制劑、衣殼抑制劑、HBV聚合酶抑制劑、HBV X蛋白(hepatitis X protein，HBx)靶向藥物、HBsAg抑制劑、RNA干擾(RNAi)類藥物，靶向HBV生命周期的不同環節[2-3]。雖然上述部分抗病毒藥物可通過有效阻斷肝細胞發生再感染或病毒復制從而切斷cccDNA生成途徑，但遺憾的是，目前尚未見直接靶向cccDNA使之永久失活或清除的藥物[4]。

研究cccDNA合成、轉錄和穩定性調控機制，并在此基礎上開發出靶向cccDNA的有效藥物是實現乙型肝炎治愈的重大科學問題。本文將簡要回顧cccDNA基礎研究領域的進展，重點圍繞cccDNA沉默或清除策略介紹在研乙型肝炎新藥并進行討論。

1 cccDNA的生物學特征

1.1 cccDNA的形成機制 HBV屬于嗜肝DNA病毒，其通過與肝細胞膜上受體牛磺膽酸鈉離子共轉運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)結合并進入肝細胞[5]。隨后病毒基因組部分環狀雙鏈DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)釋放入細胞核，并修復為cccDNA，具體包括3個環節：(1)去除rcDNA負鏈5′端共價結合的病毒P蛋白以及5′-flap結構；(2)去除rcDNA正鏈5′端RNA引物并補齊不完整的正鏈；(3)連接正負鏈末端缺口。體外生化體系的研究[6-7]顯示，rcDNA修復為cccDNA至少需要包括瓣結構特異性核酸內切酶1(FEN1)、人增殖細胞核抗原(PCNA)、復制因子C復合物(RFC)、DNA聚合酶δ(Polδ)和ATP依賴性DNA連接酶Ⅰ(LIG1)5個因子參與。cccDNA的形成是HBV侵入細胞后在細胞內進行復制的起始步驟，也是建立病毒感染狀態的最重要標志[8]。

1.2 cccDNA的轉錄調控機制 cccDNA轉錄是HBV完成生活周期的關鍵環節之一，其轉錄受到宿主因子和病毒蛋白的雙重調控。靶向cccDNA轉錄是提高乙型肝炎功能性治愈率的重要手段。目前，研究較為明確的是，有多種普遍分布的轉錄因子(TBP、AP-1、Sp1、NF-1、CREB等)和肝組織富集轉錄因子(HNF1、HNF3、HNF4、C/EBP、PPARα等)可結合于HBV基因組增強子或啟動子區域，并調控HBV的轉錄過程[9-11]。近年來，參與DNA甲基化和組蛋白修飾的宿主因子在cccDNA轉錄活性中的作用逐漸被揭示。研究[12]表明，DNA甲基轉移酶(DNMT1、DNMT2、DNMT3)通過作用于HBV基因組中的CpG島導致cccDNA高度甲基化，抑制其轉錄活性；組蛋白乙酰基轉移酶p300、CBP、HAT1等可增加 cccDNA組蛋白乙酰化水平，增強cccDNA轉錄活性，相反，組蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC11則降低cccDNA組蛋白乙酰化水平并抑制其轉錄活性[13-14]；除此之外，多種蛋白甲基轉移酶如SETDB1、PRMT1、PRMT5等也被證實通過調控cccDNA組蛋白甲基化水平增強或減弱cccDNA轉錄功能[15-16]。本課題組也發現組蛋白去乙酰化酶SIRT3可協同組蛋白甲基轉移酶SETD1A和SUV39H1抑制cccDNA轉錄[17]。近年來，隨著高分辨質譜分析技術的進步，巴豆酰化、琥珀酰化、丙酰化、丙二酰化、丁酰化等多種新型組蛋白修飾類型相繼被發現[18-22]。這些發現為進一步拓展對cccDNA微染色體表觀遺傳修飾類型的認識提供了依據，同時也將為發展表觀遺傳治療等新型抗病毒策略奠定基礎。

隨著對宿主因子在cccDNA轉錄調控中作用的認識逐漸深入，病毒蛋白HBx也被證實對cccDNA轉錄的起始和維持發揮關鍵作用。研究[23]表明，當HBx存在時，組蛋白乙酰基轉移酶PCAF/GCN5和CBP/p300被募集到cccDNA，而蛋白去乙酰化酶HDAC1和SIRT1與cccDNA的結合減少，激活cccDNA的轉錄；HBx缺失時，組蛋白甲基轉移酶SETDB1和PRMT1等結合到cccDNA，并導致cccDNA轉錄活性下降[24]。此外，HBx也可增加宿主限制因子Smc5/6、STIM1、ZEB2和PSME4的泛素化水平，誘導其降解，從而增強cccDNA轉錄活性[25-26]。這些研究發現提示，靶向宿主因子和病毒蛋白HBx是失活cccDNA轉錄功能的重要策略，同時也為提高乙型肝炎功能性治愈率提供潛在的研究方向。

1.3 cccDNA的降解機制 除上述cccDNA合成與轉錄外，cccDNA降解是另一個影響CHB治愈的重要因素。HBV cccDNA半衰期是評估cccDNA降解的重要指標，但目前cccDNA的半衰期尚無定論。基于土撥鼠和鴨HBV感染模型的研究[27-28]提示，cccDNA的半衰期為33 d和57 d；盡管在靈長類動物黑猩猩上的研究[29]發現，急性感染時cccDNA半衰期約為3 d，但仍有少量cccDNA可持續數年。遺憾的是，目前尚無法獲悉人感染肝細胞中單個cccDNA分子確切的生命周期。早期有數學模型推算在核苷和核苷酸類藥物持續治療下，機體完全清除肝內cccDNA至少需15年[30]；而Huang等[31]一項研究推測肝內cccDNA的半衰期在6個月左右。

解析cccDNA的降解機制，對于設計和評估抗病毒治療策略十分重要。但目前對于cccDNA降解機制認識十分有限。2014年的一項研究[32]首次報道了胞苷脫氨酶APOBEC3A在促進cccDNA降解中的作用。2021年德國的研究者[33]進一步發現，干擾素刺激蛋白20與APOBEC3A協同作用，可有效降解HBV cccDNA。同時，本團隊的研究[34]發現泛素結合酶UBE2L3通過泛素-蛋白酶體途徑加速APOPEC3A的降解，從而有利于維持HBV cccDNA高穩定性。上述研究充分說明了胞苷脫氨酶APOBEC3A在cccDNA降解中的重要作用。但其他調控cccDNA降解的分子機制尚需探索，解析cccDNA降解機制仍是目前亟待解決的難點。

2 靶向cccDNA的藥物研發進展

隨著對cccDNA形成、轉錄和降解3個重要生物學過程調控機制的認識加深，以靶向清除cccDNA為目標的抗病毒治療策略也日益增多。靶向HBV cccDNA的治療策略被認為是最有可能清除HBV的手段。

2.1 抑制cccDNA形成藥物研發進展 從理論上講，抑制cccDNA形成的方式有兩種，即阻斷HBV感染和抑制rcDNA修復形成cccDNA。在病毒復制周期中，HBV通過表面preS1與肝細胞特異性受體NTCP結合進入肝細胞。基于此特性，MYR Pharma公司等研發了一種合成肽Myrcludex B，通過與HBV preS1競爭性結合NTCP，從而阻斷HBV感染肝細胞[35]。此類通過靶向NTCP阻斷HBV感染從而抑制cccDNA形成的藥物還有hzVSF(Ⅱ期)、A2342(臨床前)等。目前，Myrcludex B已經進Ⅱb期臨床試驗，其臨床主要針對HBeAg陰性CHB患者，共納入40例，每日使用1次Myrcludex B，皮下注射0.5、1、2、5、10 mg治療12周(每種劑量8例受試者)。臨床數據顯示Myrcludex B耐受性良好，并觀察到8例接受10 mg Myrcludex B治療的患者中有6例(75%)在第12周出現HBV DNA下降>1 log10，40例患者中有22例(55%)ALT恢復正常。盡管Myrcludex B是一個很有希望的新型抗乙型肝炎藥物，但仍存在幾點問題有待進一步解決：(1)Myrcludex B只能抑制HBV再感染，而對已感染肝細胞中的cccDNA沒有影響，肝人源化小鼠模型中顯示一旦停用Myrcludex B，HBV復制出現反彈[36]。(2)研究[37]發現HepG2細胞模型中NTCP S267F突變會導致肝細胞對HBV易感性喪失，同時基因分析發現部分CHB患者為NTCP S267F變體純合子[38-39]。以上數據提示NTCP可能不是HBV感染的唯一途徑，針對NTCP的治療策略可能無法完全阻斷HBV感染。(3)NTCP的正常生理功能是運輸膽汁酸，Myrcludex B并不能將病毒進入的抑制與膽汁酸轉運的抑制完全分離，長期治療可能會對患者產生不同程度的副作用。

值得一提的是李文輝教授團隊研發出全人源性單克隆抗體HH-003。該藥物直接靶向HBV表面大包膜蛋白的前S1(PreS1)區，阻斷病毒與受體NTCP結合。一項基于64例慢性HBV感染者的 Ⅰ b期臨床試驗中，未觀察到與藥物相關的嚴重不良事件以及與藥物相關的3級及以上不良事件。該藥物目前已進入Ⅱ 期臨床試驗，HH-003抗病毒活性、安全性和藥代動力學等，有待進一步評估。

而在抑制rcDNA修復形成cccDNA這一策略中，目前研究發現兩種結構相關的二取代磺酰胺類(DSS)藥物CCC-0975和CCC-0346能有效干擾rcDNA轉化為cccDNA，從而阻斷cccDNA形成[40]。但是該類藥物抗病毒效能僅在培養細胞和原代鴨肝細胞中進行了驗證。

2.2 失活cccDNA新藥研發進展 RNAi是一種利用小分子雙鏈RNA特異性降解細胞內同源mRNA，從而關閉靶基因表達的技術[41]，是目前全球用于開發乙型肝炎創新藥物技術之一。siRNA通過和HBV RNA相互作用，從而促進HBV所有轉錄本的降解。現有多項采用RNAi技術的新藥進入人體臨床試驗。ARO HBV(JNJ-3989)是由Arrowhead與Janssen Pharmaceuticals公司共同開發用于CHB治療的RNAi療法藥物。該藥物由兩種靶向HBV RNA的siRNA組成并經N-乙酰半乳糖胺修飾，通過與脫唾液酸糖蛋白受體結合進入肝細胞，誘導HBV RNA降解，實現失活cccDNA的目標。目前JNJ-3989已經完成Ⅱa期臨床試驗，其納入40例CHB患者。受試者在使用核苷類藥物的基礎上，需接受3次皮下注射JNJ-3989，注射劑量分別為100 mg(n=8)、200 mg(n=8)、300 mg(n=16)或400 mg(n=8)，每4周用藥1次。研究結果顯示，JNJ-3989聯合核苷類藥物治療使39例患者實現了>1 log10IU/mL的HBsAg降低，且在392 d的試驗過程中，未報告嚴重的不良事件或終止治療事件。此外，目前在研的RNAi藥物還有VIR-2218(Ⅱ期)、RG6346(Ⅱ期)、AB729(Ⅱ期)、RBD1016(Ⅰ期)和BB-103(臨床前)等。但基于RNAi技術藥物研發有以下幾點值得注意。(1)靶向性：siRNA不具備對肝組織或細胞的靶向能力，且穿透細胞膜的能力極差。(2)穩定性：siRNA在人體循環系統中易被血液核酸酶降解，穩定性較差。(3)脫靶效應：siRNA可能依靠部分堿基與非靶基因結合，從而誘發與靶基因無關的脫靶效應。如果以上技術障礙取得突破，將推動RNAi藥物更快地走向臨床。

病毒蛋白HBx在啟動和維持cccDNA轉錄過程中發揮關鍵作用。因此靶向HBx蛋白是實現cccDNA轉錄關閉的重要手段，而以HBx為靶點的藥物研發近年也在不斷進展。EYP001(Vonafexor)是ENYO Pharma公司研發的非膽汁酸第二代FXR激動劑，數據顯示Vonafexor通過干擾核受體FXR與HBx的相互作用從而有效抑制HBV cccDNA轉錄。其Ⅱb期的臨床結果顯示，EYP001聯合聚乙二醇干擾素治療CHB患者16周后，HBsAg平均降低≥1 log10。本課題組也發現雙香豆素可靶向HBx并促進其降解，進而顯著抑制HBV cccDNA的轉錄，并在HBV感染細胞和小鼠模型中展現了較好的抗病毒效果，但目前尚缺乏臨床研究數據[42]。

2.3 誘導cccDNA降解藥物研發進展 除抑制cccDNA形成或失活cccDNA的藥物研發外，通過細胞因子介導或基因編輯技術等誘導cccDNA降解也被認為是HBV新藥發展的重要方向。研究[43]發現淋巴毒素-β受體(LTβR)激動劑可刺激肝細胞內APOBEC3B的表達，并通過誘導cccDNA脫氨基觸發其非細胞溶解性降解，且在停止藥物處理后仍具有抑制病毒的作用。但LTβR激動劑僅在HBV感染肝細胞和小鼠模型上進行了驗證，其抗病毒作用仍然需要長期的臨床試驗去進一步證實。

基因編輯技術既可通過對cccDNA引入插入或缺失突變導致HBV病毒蛋白異常表達從而影響病毒復制，同時也可誘導部分cccDNA降解實現cccDNA的清除。基于序列特異性核酸酶的基因編輯方法已被研究應用于治療病毒感染。PBGENE-HBV是Precision BioSciences開發的一種利用ARC核酸酶靶向HBV cccDNA的基因編輯藥物，其通過脂質納米顆粒傳遞至肝細胞并靶向cccDNA。臨床前研究數據顯示PBGENE-HBV可有效降解HBV感染的原代人肝細胞中的cccDNA，其有效率達75%，并伴隨HBsAg水平的降低。小鼠實驗也顯示，單次給藥后，PBGENE-HBV可對70%的HBV DNA靶標進行編輯。類似的基于基因編輯的藥物還有EBT107、Undisclosed等，均處于臨床前研究階段。雖然基因編輯藥物研發是一個高度活躍的研究領域，但也存在一些風險和限制，首先基因編輯系統對目標基因識別不是絕對特異性的，通過對基因編輯技術處理過的細胞進行基因組深度測序，可以明顯觀察到脫靶效應[44]；其次暫沒有研究證明基因編輯技術可有效識別整合線性HBV DNA和游離的cccDNA，如果整合在染色體上的HBV DNA被切割，將極大可能導致宿主細胞染色體受損；此外，基因編輯治療的選擇壓力會導致HBV產生耐藥突變，因此應針對cccDNA設計多個編輯靶點，以盡量減少耐藥變體的出現[45]。

3 小結與展望

尋找清除或失活cccDNA的最終方案，是一個系統問題，既涉及基礎科學問題，也涉及臨床問題。目前，HBV cccDNA研究仍面臨許多挑戰，包括：(1)HBV具有宿主特異性，目前仍缺少理想的研究cccDNA的細胞和動物模型。(2)cccDNA數量少，且易受rcDNA的干擾，目前尚缺乏標準的高敏感性cccDNA檢測方法。(3)缺乏可直接表征cccDNA功能狀態的新方法與新模型。(4)發展靶向失活或清除cccDNA的策略，有利于最終治愈HBV感染，但關于cccDNA活性調控和清除的機制目前尚未完全闡明。(5)臨床上，迫切需要能夠指示肝內cccDNA活性的新型血清標志物。(6)結合免疫治療的多途徑、多靶點藥物聯合阻斷HBV的生物學合成并促進cccDNA清除將可能成為治愈CHB的重要途徑。但是新型免疫治療策略能否重建HBV特異性T淋巴細胞功能，并有效清除或失活cccDNA，也需要進一步明確。圍繞以上諸多問題的多維度研究，將為尋找清除或失活HBV cccDNA的最終方案奠定基礎。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：陳娟負責收集資料并撰寫文章；黃愛龍負責文稿修訂并最終定稿。