外泌體在原發性膽汁性膽管炎中作用的研究進展

馬海濤， 唐映梅

昆明醫科大學第二附屬醫院 消化內科， 昆明 650101

原發性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以女性發病為主的慢性進行性自身免疫性肝病，其特點是慢性進行性小膽管破壞和肉芽腫性淋巴細胞性膽管炎，具有典型的抗線粒體抗體(AMA)血清反應陽性[1]。PBC發病機制尚未完全明了，更有效的治療方法還有待研究[2]。如未經規范治療，PBC可進展為終末期肝病如肝硬化和肝衰竭，需要進行肝移植[3-4]。目前的研究表明，外泌體參與了PBC的發生發展，同時多種干細胞來源的外泌體對PBC疾病可能起到保護和治療的作用。本文回顧了近年來外泌體及其攜帶的多種分子在PBC中的作用并作一總結，以此為PBC的發病機制研究及臨床應用提供理論依據。

1 外泌體概述

外泌體(exosomes)是一類直徑在30～200 nm大小不均的細胞外囊泡，幾乎所有類型的細胞都可以生成和分泌外泌體，其廣泛存在于人體血液、母乳、膽汁和尿液等多種體液中[5-6]。外泌體是由細胞中的多囊泡內體發育成熟時內膜向內萌發而形成，當多囊泡內體與細胞膜融合時分泌到細胞外的一種腔內囊泡[7]。外泌體內含有多種生物活性分子如蛋白質(過氧化物酶、丙酮酸激酶、跨膜蛋白、脂質錨定內膜蛋白、內周膜蛋白等)、DNA(單鏈DNA、雙鏈DNA、基因組DNA、線粒體DNA和反轉錄的互補DNA等)以及RNA[mRNA、microRNA、環狀RNA(circRNA)、長鏈非編碼RNA (lncRNA)等]和脂質，它們參與細胞間信號轉導并調節各種生理活動[5]。

目前已知外泌體最主要的功能是在鄰近和遠處的細胞間穿梭以傳遞不同的信號分子，參與細胞間信號通訊。外泌體通過巨胞飲、吞噬作用、網格蛋白介導的內吞作用和非網格蛋白介導的內吞作用等多種方式被受體細胞攝取后，其內攜帶的多種生物分子可調控受體細胞內下游的多個信號通路而在調節細胞活化和增殖、代謝、免疫反應和抗病毒反應等方面發揮重要的生物學功能[5,7-8]。此外，外泌體還可以轉移Ⅰ類、Ⅱ類主要組織相容性復合體和抗原，具有抗原呈遞功能[9]。

作為一種細胞間的通訊媒介，外泌體不僅在機體正常的生理穩態中發揮作用，而且在感染性疾病、代謝性疾病和癌癥等多種疾病的發病和進展中也飾演著重要的角色[8,10]。隨著生命科學和醫學探索的不斷深入，外泌體在自身免疫性疾病中的相關研究逐漸成為當前醫學領域的一大熱點，其在PBC疾病中的研究也有了一些重要的進展。

2 外泌體在PBC疾病中的作用

大量研究[11-12]表明，外泌體具有誘導抗原特異性免疫和引發炎癥反應的功能。來自不同細胞群體的外泌體可以在不同個體的免疫微環境中介導免疫激活或免疫抑制從而在自身免疫性疾病的免疫反應中發揮不同的作用。PBC是一種典型的以肝臟發生病理生理改變為主的器官特異性自身免疫性疾病,對PBC相關外泌體的深入研究可能有助于PBC發病機制的進一步闡明。

2.1 循環外泌體可調節APC共刺激分子的表達 已有多項研究[13]證實，抗原遞呈細胞(APC)可誘導自身反應性T淋巴細胞分泌多種炎癥因子維持PBC肝臟炎癥，并可介導PBC膽管損傷。Tomiyama等[14]在對PBC患者和正常人外周血單個核細胞(PBMC)的分析中發現，血液循環中存在的外泌體可顯著增加CD14+單核細胞表面CD86分子的表達，同時，CD40分子在CD11c+樹突狀細胞上的表達增加，而在B淋巴細胞上的表達降低(圖1a)，但PBC患者體內的循環外泌體并不能誘導外周血中的單核細胞產生炎性因子。CD40和CD86是循環外泌體誘導的PBC免疫應答過程中APC活化的兩個關鍵共刺激分子，循環外泌體通過調節這兩個分子在APC亞群中的表達而影響APC活化。這些結果表明，循環中的外泌體對單核細胞功能的調控作用是通過調節細胞共刺激分子表達的改變而不是誘導細胞分泌炎性因子產生的。此外，研究發現外泌體中含有PBC疾病的主要自身抗原PDC-E2，可能隨外泌體進入細胞后被細胞加工進一步參與PBC中APC的活化。

研究者還在PBC患者和健康對照者的循環外泌體中篩選出了18個差異表達較為顯著的miRNA，其中miRNA-451a和miRNA-642a-3p的水平明顯升高，表明外泌體中的miRNA可能參與PBC疾病進程中調節APC上共刺激分子的表達[14]。近年來研究[15-16]提示miRNA-451a與多種自身免疫性疾病的發生發展相關，但目前尚未見miRNA-642a-3p在自身免疫性疾病中的相關報道。然而，這兩個miRNA水平上調的程度與PBC病情的進展無關，可能與該項研究的患者正在接受熊去氧膽酸的治療有關，需要更多的研究來確定外泌體miRNA水平是否與PBC疾病的嚴重程度相關。

2.2 膽管細胞來源的外泌體可介導生物分子向肝內細胞轉移

越來越多的研究[6,17]表明，外泌體介導的各種生物大分子的轉移與多種肝臟疾病有著密切的關系。此前一項研究[18]表明衰老的膽管細胞可釋放大量的外泌體，這些含有多種生長因子的外泌體進入正常膽管細胞和巨噬細胞等靶細胞后可改變這些靶細胞表型而影響膽汁淤積性肝損傷。

lncRNA H19(簡稱H19)是目前研究最廣泛的lncRNA，位于人類第11號染色體上。生理條件下，H19在除骨骼肌外的幾乎所有組織中均下調，H19的異常表達常常與包括PBC在內的多種肝臟疾病密切相關[19]。Li等[20]研究發現，在膽汁淤積條件下，雌激素和牛磺膽酸通過其同源受體誘導ERK1/2信號通路的激活而上調膽管細胞中H19的表達并促進攜帶了H19的外泌體的釋放，攜帶H19的外泌體直接或通過血液循環被肝臟內的細胞攝取后抑制肝臟細胞中小分子異二聚體伴侶的表達進而導致膽汁酸合成增加，最終加重淤膽性肝損傷。該團隊進一步發現，肝星狀細胞(HSC)和HSC來源的成纖維細胞是膽管細胞來源外泌體最主要的靶細胞。PBC小鼠模型中的所有肝臟實質細胞和非實質細胞中，HSC攝取的膽管細胞來源的外泌體最多，進入細胞的外泌體H19可調節HSC的G1/S細胞周期轉變，對HSC的激活和增殖起著關鍵的促進作用(圖1b)，進而參與PBC疾病肝纖維化的發生發展[21]。然而，外泌體H19介導的HSC激活的潛在機制仍有大部分未知，需要更深入的研究以闡明。

眾所周知，Kupffer細胞和單核細胞來源的巨噬細胞激活后會產生多種細胞因子和趨化因子，在PBC的膽管損傷和肝臟炎癥中起著重要作用[13,22]。膽管細胞來源的外泌體H19可被駐留在肝臟內的Kupffer細胞攝取，誘導Kupffer細胞激活并向M1方向極化，刺激Kupffer細胞分泌趨化因子配體2(CCL-2)和IL-6并通過CCL-2/CCR-2信號通路促進單核細胞來源的巨噬細胞活化、遷移及M1極化和炎癥細胞浸潤(圖1b)，促進PBC疾病肝臟炎癥的發展[23]。

3 外泌體在PBC臨床診療中的作用

PBC病因未明，缺乏明確的早期非侵入性診斷和預后判斷的手段，同時也缺乏足夠的治療靶點和特異性的治療藥物。因此，尋找診斷和治療PBC的新方法仍是未來臨床和基礎研究的首要任務。隨著外泌體提取、保存及檢測技術的日益更新，外泌體在各種疾病中的應用前景也越來越廣闊[24-25]。外泌體存在于幾乎所有體液中，因其有脂質雙分子層可在血清中處于相對穩定狀態，且外泌體含有來源于細胞的組織特異性蛋白和核酸，其數量和含量可隨著疾病狀態的不同而變化，有望成為一種新型診療方法[26]。

3.1 外泌體可能是PBC潛在的診斷標志物

建立準確度高、特異性強、安全性好的早期診斷方法是防治PBC的關鍵環節之一。目前臨床中診斷PBC的特異血清學指標為AMA，然而，多項研究[27]指出AMA陽性與PBC疾病的嚴重程度和預后無關，且5%～10%的PBC患者血清AMA陰性，此類患者無核心診斷指標。一些外泌體本身以及外泌體含有的多種ncRNA已被確定為多種肝病潛在的診斷標志物，如病毒性肝炎、藥物性肝損傷、酒精性肝病、肝細胞癌和膽管癌[8]。也有一些研究提示外泌體及其攜帶的多種核酸分子可能在PBC診斷和預后中有一定的應用價值。

3.1.1 外泌體microRNA(miRNA) miRNA是一類長度為20～24個核苷酸組成的高度保守的非編碼小RNA，參與多種基因表達轉錄后水平的調控，在細胞的增殖分化、代謝和凋亡等過程中發揮關鍵的激活或抑制作用[28]。外泌體固有的脂質雙分子層具有較好的穩定性可使外泌體中攜帶的miRNA分子不易被降解，因此常常被認為是理想的疾病活動性和預后判斷的生物標志物[29]。

大量研究[30]證實了外泌體和miRNA可以作為潛在的非侵入性生物標志物準確地識別、預測和治療包括PBC在內的多種膽道疾病。目前已經發現多個 miRNA 在 PBC患者和正常人的血清以及PBMC中差異表達，呈現出PBC特異的血清學miRNA 表達譜，在眾多差異表達的外泌體miRNA中，外泌體miRNA-506可能對PBC患者的診斷和預后有重要的潛在應用價值[2,9]。近期有研究[31]發現在AMA陰性PBC患者血清中miR-21和miR-150的表達顯著增強，并且與患者的血清AMA抗體滴度呈負相關，miR-21和miR-150及其下游靶基因的顯著改變可能是AMA陰性PBC患者的特征性表現。這些研究結果顯示，多種外泌體miRNA可能參與PBC進程，檢測PBC患者血清和尿液中的外泌體miRNA有可能成為PBC疾病的早期非侵入性診斷和預后判斷的一種方法。然而，外泌體miRNA在PBC疾病診斷中的研究仍處于早期的臨床前階段，與真正應用到臨床診斷中還有很大的差距。

3.1.2 外泌體lncRNA lncRNA是一類長度超過200個核苷酸而不具備編碼蛋白質功能的RNA，可在不同水平上調控基因表達，在機體的生理和病理活動中發揮重要作用[32]。然而，lncRNA的穩定性較差，很容易被血液中的RNase降解，因此很難直接檢測到血液中的lncRNA，循環中的外泌體可以保護lncRNA不被降解進而放大lncRNA作為診斷標志物的潛能[33-34]。

不同來源的外泌體lncRNA與各個系統的多種良性疾病和惡性腫瘤的發生發展密切相關，可作為一種無創的臨床診斷和預后評價的標志物[35-37]。一項基因組研究[38]發現lncRNA共有38個單核苷酸多態性位點與PBC密切相關，其中21個位點也與其他自身免疫性疾病相關。另有研究[39]發現lncRNA AK053349在PBC患者PBMC中表達增加，并與Mayo風險評分呈正相關，可能在PBC發病中有潛在作用。最近的研究[21]發現，PBC患者血清外泌體lncRNA H19水平在晚期肝硬化患者中顯著上調并與肝臟H19水平和膽汁淤積性肝損傷的肝纖維化程度密切相關，提示循環外泌體H19水平可能是PBC臨床診斷的潛在血清標志物和預后評估的重要指標，但其敏感性和特異性還需進一步研究加以驗證。這些研究結果表明外泌體lncRNA可能是PBC疾病的潛在生物標志物，為外泌體lncRNA在臨床診斷中的應用提供了理論基礎。

3.2 外泌體在PBC治療中的研究 熊去氧膽酸(UDCA)是目前治療PBC疾病的一線用藥，但仍有約40%的患者服用UDCA的療效不佳，迫切需要尋找一些新的治療方法來控制此類患者的病情[2]。由于外泌體在人體內的生物相容性較好且體液中的外泌體具有天然的穩定性和靶向性，其本身或作為靶向治療藥物的載體在疾病治療中的研究也越來越廣泛[10,40]。

間充質干細胞具備獨特的自我更新能力和多向分化潛能受到研究者的廣泛關注，但因其安全性備受爭議而限制了它在臨床中的應用。間充質干細胞來源的外泌體富含生物活性分子，更易生產和儲存，沒有活細胞而不具有成瘤風險,可作為一種理想的無細胞療法提供一些新的治療策略[41]。肝纖維化被認為是包含PBC在內的各種肝病中晚期共同出現的病理變化，有研究[42]發現，人骨髓間充質干細胞來源的外泌體可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來控制HSC的活化增殖進而減輕肝纖維化小鼠模型的纖維化程度，此外，人骨髓間充質干細胞來源的外泌體還可抑制肝臟炎癥和促進肝細胞再生。大量研究證實膽管上皮細胞衰老是PBC疾病重要的病理改變之一， Chen等[43]采用氧化應激(H2O2)誘導膽管細胞衰老后與人胎盤間充質干細胞(Hpmsc)來源的外泌體共培養后發現，Hpmsc來源的外泌體可通過調節細胞周期相關抑制衰老的蛋白p21WAF1/-Cip1和p16INK4a以及減少衰老相關分泌表型組分和趨化因子的表達從而延緩膽管細胞衰老的進程并促進膽管細胞增殖衰老而產生保護作用。這些研究結果對尋找PBC疾病治療的新方法具有重要意義，雖然目前外泌體尚未應用于臨床診療，但是隨著探索的不斷深入，外泌體可能在不久的將來成為治療PBC疾病的理想工具。

4 小結與展望

綜上所述，各種來源的外泌體及其攜帶的不同生物分子在PBC疾病的各個階段中有著不同的作用并有望發展為PBC早期診斷、預后評價和精準治療的無創性工具。雖然近幾年關于外泌體與PBC疾病的研究取得了許多進展，但外泌體在PBC發生發展中的分子機制仍需進一步探索，外泌體的分泌和定向細胞攝取的機制尚不明了。此外，標準化、高通量分離和提取外泌體的方法仍處于探索階段，這些問題給外泌體在PBC疾病中的臨床應用帶來了極大的挑戰。目前有關外泌體在PBC疾病中的研究還有許多問題有待闡明，但隨著研究的不斷發展和技術的日益更新，外泌體將會為PBC疾病的發病機制探索和臨床診療帶來更多的新思路和新方法。

利益沖突聲明：所有作者均不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：馬海濤負責起草文章，對行文的思路和設計有關鍵貢獻；唐映梅參與了修改文章關鍵內容。