ZmDREB2.7正調(diào)控玉米耐旱性的功能分析

劉升學(xué)，常淑杰，劉曉虎，馬 超，秦 峰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院，北京 100193)

玉米不僅是重要的糧食作物，同時(shí)也是重要的飼料和工業(yè)原料，而且又是對(duì)水分脅迫較為敏感的作物[1]。盡管全球玉米種植面積和產(chǎn)量取得了突飛猛進(jìn)的增長(zhǎng)，但是干旱、高鹽堿、極端溫度等非生物逆境嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量進(jìn)一步提高。在諸多環(huán)境脅迫因素中，干旱對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的威脅是最嚴(yán)重的一個(gè)世界性問(wèn)題[2]。因此，提高農(nóng)作物尤其是玉米的耐旱性已逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迫切需求。然而，植物耐逆性屬于復(fù)雜數(shù)量性狀，單純依靠傳統(tǒng)的育種手段改善植物的抗逆性，已難以滿足此類性狀遺傳改良的需要，隨著植物分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)分子設(shè)計(jì)的手段培育抗旱品種逐漸成為提高作物抗旱性的可能途徑[3-4]。干旱是常見(jiàn)的嚴(yán)重影響農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量的非生物脅迫因子之一，也是目前抗逆分子生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一。在玉米(ZeamaysL.)、水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)、大麥(HordeumvulgareL.)、大豆(Glycinemax)和番茄(Solanumlycopersicum)中的研究表明，DREB/CBF、MYB、NAC、bZIP和WRKY等轉(zhuǎn)錄因子主要參與調(diào)控響應(yīng)水分脅迫的基因表達(dá)[5-9]。諸多轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明，DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子基因無(wú)論是在雙子葉和單子葉植物，還是在草本及木本植物的抗逆遺傳改良中均有很好的應(yīng)用前景[10-13]。

前期通過(guò)368份玉米自交系的苗期存活率表型與玉米基因組中18個(gè)ZmDREB基因的遺傳變異進(jìn)行候選基因的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，ZmDREB2.7基因啟動(dòng)子區(qū)域的遺傳變異與玉米耐旱性顯著相關(guān)[10]。本研究利用ZmDREB2.7玉米轉(zhuǎn)基因材料和近等基因系材料，在正常生長(zhǎng)和干旱脅迫條件下，比較轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因材料以及不同近等基因系間耐旱性，分析ZmDREB2.7基因?qū)τ衩渍ＩL(zhǎng)和耐旱性的影響，以及不同ZmDREB2.7等位基因型的遺傳效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米(ZeamaysL.)自交系A(chǔ)188、玉米ZmDREB2.7轉(zhuǎn)基因材料、玉米自交系CIMBL70、玉米自交系CIMBL92、玉米自交系SHEN5003、ZmDREB2.7近等基因系材料、根癌農(nóng)桿菌(Agrobactriumtumefaciens)菌株EHA105、中間載體質(zhì)粒 pSBⅡ，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米課題組保存。

1.2 載體的構(gòu)建與鑒定

以耐旱玉米自交系CIMBL70基因組DNA為模板，將ZmDREB2.7基因(～700 bp 啟動(dòng)子區(qū)及 5′和 3′UTR)通過(guò) PCR 擴(kuò)增并克隆到載體 pBlueScript ⅡSK的EcoRⅤ位點(diǎn)。經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列正確后，經(jīng)SmaⅠ和HindⅢ酶切后克隆到載體pSBⅡ。將測(cè)序和酶切證實(shí)的質(zhì)粒與pSBⅠ載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，重組后獲得載體 pSBⅢ，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。克隆引物序列ZmDREB2.7-1 F：5′-GTCCGTCAGTCCGTCCTTG-3′,ZmDREB2.7-1 R:5′-CCACGAATAACTAGGAGAAATA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為2 013 bp；標(biāo)記基因序列：BAR-F:5′-CAATCCTCGAGTCTACCATGAGCCC-AGAAC-3′和BAR-R:5′-GAATCCTCGAGTC-AAATCTCGGTGACGGGCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500 bp。

1.3 ZmDREB2.7轉(zhuǎn)基因材料的創(chuàng)制

取授粉后10～15 d的A188幼穗剝?nèi)グ~，剝離花絲，先用75%酒精浸泡幼穗15 s，再用 0.1%升汞溶液浸泡10 min；用滅菌的吸水紙吸干幼穗表面的溶液，固定幼穗(例如，從穗子底部將鑷子插入穗芯)，用滅菌刀片削去籽粒頂部60%，挑出幼胚，選擇1～2 mm的幼胚盾片向上排列在培養(yǎng)基上，用于誘導(dǎo)愈傷組織。后續(xù)農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備、農(nóng)桿菌侵染愈傷組織、抗性愈傷篩選均按照實(shí)驗(yàn)室的操作流程[14]。轉(zhuǎn)基因材料特異鑒定引物ZmDREB2.7-2 F：5′-ACCACCAGACGATGTTCCA-3′和ZmDREB2.7-2 R：5′-GGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGA-CACC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為850 bp。

1.4 近等基因系的構(gòu)建與鑒定

選擇攜帶優(yōu)異等位基因型的玉米自交系CIMBL70、CIMBL92與敏感基因型自交系SHEN5003進(jìn)行雜交，通過(guò)連續(xù)回交將其優(yōu)異等位基因型導(dǎo)入輪回母本SHEN5003中，建立兩套耐旱基因的近等基因系(世代BC5F3)。玉米自交系CIMBL70和CIMBL92，攜帶ZmDREB2.7基因的啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)顯著位點(diǎn)具有相同的等位基因型，正與SHEN5003相反。利用InDel-21設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR分型，區(qū)分回交單株的ZmDREB2.7基因的等位基因型，ZmDREB2.7-3 F：5′-CGAGGACTGCATTGCTAGCA-3′，ZmDREB2.7-3R:5′-GCGGCGGCACCCGATCCAT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為70/91 bp。

1.5 ZmDREB2.7轉(zhuǎn)基因和近等基因系植株轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)

從不少于3棵苗中取樣、用液氮速凍，用TRIZOL(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，Bioteke)法分離出總RNA，緊接著用DNAseⅠ(寶生物(大連)工程有限公司，Takara)法消除基因組的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific product, USA)測(cè)定濃度，統(tǒng)一取5 μg進(jìn)行 0.8%瓊脂糖膠。取1 μg總RNA，用重組M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(普洛麥格生物技術(shù)有限公司，Promega)，以O(shè)ligo(dT)23(Promega)為引物，進(jìn)行cDNAs的合成。采用熒光定量PCR，以ZmUbi-2(UniProtKB/TrEMBL; ACC:Q42415)為內(nèi)參，分析ZmDREB2.7的相對(duì)表達(dá)量。采用ABI公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(Stepone Real-Time PCR System)和寶生物染料法熒光定量試劑盒(TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM)完成。最后，以2-ΔΔCt法計(jì)算ZmDREB2.7的相對(duì)表達(dá)量[10]。ZmDREB2.7-4 F：5′-TATGATGATGATGCACTCC-3′，ZmDREB2.7-4 R:5′-GAG-TTGGAAATGGAATCG-3′;ZmUBI-2-1 F:5′-TGGTTGTGGCTTCGTTGGTT-3′，ZmUBI-2-1 R：5′-GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA-3′。

1.6 近等基因系基因型鑒定

利用CTAB(CTAB提取緩沖液使用前加入1%～2% β-巰基乙醇，并于65 ℃溫浴備用)提取親本和近等基因系基因組，然后通過(guò)中玉金標(biāo)記公司采用Maize56K SNP Array進(jìn)行掃描。利用Beckman自動(dòng)工作站進(jìn)行樣品準(zhǔn)備；再通過(guò)GeneTitan芯片系統(tǒng)完成后續(xù)的芯片雜交、洗滌、掃描等一系列步驟。

1.7 玉米苗期抗旱表型分析

將玉米播種于基質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石∶草炭 土=1∶1∶1)，每個(gè)小紅缽播種25粒種子，澆足水分在培養(yǎng)間(16 h-光/8 h-暗，28 ℃/22 ℃，空氣濕度60%)進(jìn)行催芽，7 d后芽出土約2 cm時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株移入方盒中種植。每個(gè)方盒裝入2 kg混合均勻的滅菌基質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石∶草炭土=1∶1∶1)，每個(gè)方盒種植6行，每行5株，其中左側(cè)3行為對(duì)照，右側(cè)3行為轉(zhuǎn)基因或近等基因系植株。正常條件下生長(zhǎng)10 d后開(kāi)始停止供應(yīng)水分進(jìn)行干旱處理。停水約25 d后，當(dāng)對(duì)照的干枯程度與轉(zhuǎn)基因或近等基因系植株出現(xiàn)明顯差異時(shí)開(kāi)始復(fù)水，復(fù)水3 d后統(tǒng)計(jì)各株系的存活率。一般將葉片返綠植株定義為存活植株，將表現(xiàn)為嚴(yán)重受旱且無(wú)法正常生長(zhǎng)的植株定義為死亡植株，存活率為各株系存活植株數(shù)占總植株數(shù)的百分比。試驗(yàn)至少重復(fù)3次，取多次試驗(yàn)的均值進(jìn)行苗期存活率的統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 玉米轉(zhuǎn)基因植株田間試驗(yàn)

選擇WT(A188)及ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10 T4代純合種子進(jìn)行田間表型試驗(yàn)。2018年春，在新疆農(nóng)科院安寧渠試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)基因材料大田干旱試驗(yàn)。所有試驗(yàn)材料于2018-05-15播種，2018-09-10收獲，其種植密度為58 000 株/hm2。試驗(yàn)田分3個(gè)小區(qū)，分別為水區(qū)、干旱-1、干旱-2，為排除小區(qū)之間灌溉的影響，每個(gè)小區(qū)之間間隔4 m，并在小區(qū)四周鋪設(shè)0.5 m深的隔水層。小區(qū)面積15 m2，每個(gè)小區(qū)內(nèi)設(shè)3次重復(fù)，1行區(qū)，3 m行長(zhǎng)，行距50 cm，株距25 cm，雙粒播保證齊苗(13株/行)。水區(qū)在玉米的整個(gè)生育期內(nèi)正常灌溉；干旱-1則在玉米正常生長(zhǎng)29 d后停止供水，并在玉米吐絲期(R1期)增加1次灌水；干旱-2則在玉米正常生長(zhǎng)15 d后停水供水，并在玉米V7、R1期增加兩次灌水。干旱-1和干旱-2供水水量分別為水區(qū)的60%、40%[14]。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析方法

通過(guò)Excel 2016記錄和整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。使用SPSS軟件(版本17.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmDREB2.7近等基因系的構(gòu)建和遺傳背景恢復(fù)率分析

為比較不同的ZmDREB2.7等位基因的效應(yīng)，選擇2個(gè)耐旱型玉米自交系(CIMBL70和CIMBL92)與敏感自交系(SHEN5003)雜交，再連續(xù)回交導(dǎo)入輪回母本SHEN5003中，通過(guò)特異PCR輔助選擇，建立兩套耐旱基因的近等基因系。通過(guò)Maize56K SNP Array進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示，NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的ZmDREB2.7均恢復(fù)到優(yōu)異等位基因型。NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92遺傳背景恢復(fù)率分別是94.96% 和95.11%，其中7號(hào)染色體遺傳背景恢復(fù)率低于平均值，分別是73.64%和73.48%。

2.2 ZmDREB2.7近等基因系的苗期耐旱性鑒定

為了比較ZmDREB2.7不同等位基因型的耐旱性，采用盆栽法進(jìn)行室內(nèi)苗期存活率試驗(yàn)(圖2-A)，同時(shí)檢測(cè)了用于表型試驗(yàn)的穗子的基因型(圖2-B)和表達(dá)量(圖2-C)。NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的表達(dá)量均顯著高于輪回親本SHEN5003。NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的存活率分別是81.34%和83.33%，顯著高于SHEN5003(37.3%，圖2-D)。

2.3 玉米轉(zhuǎn)基因的苗期耐旱性表型評(píng)價(jià)

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米自交系A(chǔ)188幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化體系將ZmDREB2.7基因?qū)階188基因型玉米中，通過(guò)特異PCR檢測(cè)和連續(xù)自交后，獲得T4代純合株系。采用盆栽法進(jìn)行室內(nèi)苗期存活率試驗(yàn)(圖3-A)，同時(shí)檢測(cè)了用于表型試驗(yàn)的穗子的葉片表達(dá)量(圖3-B)。ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型(A188，圖3-B)。干旱處理后，兩個(gè)純合株系ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10存活率分別是68.05%和70.83%，顯著高于A188(58.33%，圖3-C)。

2.4 玉米轉(zhuǎn)基因田間耐旱性表型評(píng)價(jià)

在大田試驗(yàn)條件下，檢測(cè)A188和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10在干旱處理?xiàng)l件下的耐受性(圖4)。在正常澆水條件下(WW)，ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10的單株產(chǎn)量顯著高于野生型(A188)，小區(qū)產(chǎn)量無(wú)顯著差異。在干旱-1處理?xiàng)l件下(輕度干旱)，ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 比野生型的小區(qū)產(chǎn)量少減產(chǎn) 37.36%。在干旱-2處理?xiàng)l件下(極端干旱)，ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10比野生型的小區(qū)產(chǎn)量少減產(chǎn)22.54%。

3 討 論

在植物響應(yīng)干旱脅迫方面，DREB類轉(zhuǎn)錄因子起著重要作用，但是關(guān)于這些基因的自然變異是否直接影響植物的耐旱性的報(bào)道很少。回答這個(gè)問(wèn)題，不僅需要剖析DREB基因的生物學(xué)機(jī)理，更需要抗逆基因工程中的應(yīng)用。分子標(biāo)記輔助選擇一般利用分子標(biāo)記選擇育種材料的目標(biāo)區(qū)域，同時(shí)篩選全基因組，減少連鎖累贅，從而加速獲得符合預(yù)期的新材料。例如，利用AC7643作為耐旱性的優(yōu)良供體親本，改良輪回親本CML247，通過(guò)2輪回交和2輪自交，最后評(píng)價(jià)改良的CML247分別與CML254和CML274測(cè)交系組配的雜交種的耐旱性，比對(duì)照和測(cè)交種更好，這也是耐旱分子標(biāo)記輔助選擇育種典型應(yīng)用案例[15]。利用攜帶的ZmVPP1耐旱基因型自交系CIMBL70和CIMBL91為供體親本，以攜帶敏感基因型的自交系SHEN5003為輪回親本，經(jīng)過(guò)4輪回交和2輪自交的后，NIL-ZmVPP1CIMBL70和 NIL-ZmVPP1CIMBL91的存活率較NIL-ZmVPP1SHEN5003顯著提升了30%[14]。本研究構(gòu)建了ZmDREB2.7的近等基因系材料，在實(shí)際生產(chǎn)中評(píng)價(jià)其優(yōu)異等位基因型的應(yīng)用價(jià)值。試驗(yàn)結(jié)果表明，NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的ZmDREB2.7基因型均回復(fù)到優(yōu)異等位基因型，遺傳背景恢復(fù)率分別是 94.96%和95.11%，表達(dá)量均顯著高于輪回親本SHEN5003，存活率分別是81.34%和83.33%，顯著高于SHEN5003(圖2)。分子標(biāo)記輔助選擇和轉(zhuǎn)基因方法一定程度上加快了育種進(jìn)程，但如何高效利用少數(shù)主效抗性基因到育種實(shí)踐中，實(shí)現(xiàn)分子設(shè)計(jì)育種還是科學(xué)家共同需要面臨的難題。利用CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)負(fù)效應(yīng)基因的定點(diǎn)敲除，或者染色體的大片段缺失，或者不良性狀相關(guān)基因簇的快速敲除，從而大大提高農(nóng)作物目標(biāo)性狀定向改良效率。

在抗逆基因工程中，啟動(dòng)子的選擇一直是轉(zhuǎn)基因工程的瓶頸，因此科學(xué)家一直努力鑒定和利用受脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。例如，Shinozaki試驗(yàn)室將DREB1A置入35S(constitutive cauliflower mosaic virus(CaMV35S)和rd29A啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株可以提高植物的抗性；正常條件下，組成型表達(dá)DREB1A的轉(zhuǎn)基因煙草株系生長(zhǎng)發(fā)育延遲、植株矮小，然而rd29A的啟動(dòng)子調(diào)控的DREB1A的轉(zhuǎn)基因煙草株系生長(zhǎng)旺盛且耐逆性增強(qiáng)[16]。本研究中，ZmDREB2.7轉(zhuǎn)基因材料用的自身啟動(dòng)子，顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的ZmDREB2.7的表達(dá)量。轉(zhuǎn)基因玉米材料ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10存活率分別是68.05%和70.83%，均顯著高于野生型(A188，58.33%)。更重要的是，在2018年新疆大田試驗(yàn)中，2.7-1和2.7-10兩個(gè)株系均表現(xiàn)較強(qiáng)的耐旱性，在干旱條件下，小區(qū)少減產(chǎn)20%以上。本試驗(yàn)中獲得的轉(zhuǎn)基因材料目前沒(méi)開(kāi)展基因上游和下游方面的相關(guān)研究。如果能進(jìn)一步分析相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，深入探索具體調(diào)控細(xì)節(jié)，解析出抑制環(huán)節(jié)和促進(jìn)環(huán)節(jié)，再利用遺傳操作技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)改良，相信會(huì)獲得較好的效果。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)構(gòu)建了不同等位基因型的近等基因系材料和自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)ZmDREB2.7的玉米轉(zhuǎn)基因材料。在苗期存活率試驗(yàn)和大田表型調(diào)查中，ZmDREB2.7基因可以顯著提高玉米苗期的耐旱性、未降低產(chǎn)量，因此該基因是較重要的苗期耐旱基因資源。本試驗(yàn)不足之處在于僅在玉米苗期而未在其他生育時(shí)期進(jìn)行研究，希望以后對(duì)玉米的各個(gè)生育時(shí)期進(jìn)行試驗(yàn)研究并綜合分析進(jìn)而篩選出更重要的抗旱基因。