贛江南昌段豐、枯水期氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)分析*

宋凱倫 汪麗娜 林益寰 周春火 譚澤彬 高陽(yáng)慧 王亞麗 尹 鑫#

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)土資源與環(huán)境學(xué)院,江西 南昌 330045;2.九江市永修縣生態(tài)環(huán)境局,江西 九江 330300)

隨著江西地區(qū)工業(yè)的迅速發(fā)展,生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的工業(yè)廢水和居民生活污水的產(chǎn)生量及排放量與日俱增,其中含有大量的氮磷、有機(jī)物及重金屬等污染物[1]。贛江作為江西省最大的河流,接收了全省大部分的污染廢水,使得水體中大量的氮磷淤積在河道底泥中,造成的水體污染問(wèn)題將直接影響周邊群眾的用水安全[2-3]。河流底泥微生物群落結(jié)構(gòu)長(zhǎng)時(shí)間受到河流環(huán)境影響,其群落結(jié)構(gòu)特征反映了河流在一段時(shí)間內(nèi)的環(huán)境變化[4],當(dāng)水體碳、氮、磷污染較重時(shí),往往伴隨著豐度更高的微生物群落[5]。研究人員發(fā)現(xiàn),在不同時(shí)期,河流水文特征，理化性質(zhì)，河流浮游植物、魚類群落結(jié)構(gòu)及微生物群落結(jié)構(gòu)都會(huì)受到較大影響[6-7]。之前有學(xué)者研究過(guò)贛江下游水體中微生物群落特征[8],但對(duì)贛江南昌段枯、豐水期底泥中的氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究相對(duì)缺乏。

在河流底泥的氮素污染降解過(guò)程中,氨氧化作為整個(gè)硝化作用的第一部分,其速率至關(guān)重要,氨氧化速率又取決于氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)的豐度及活性等因素[9]。其中氨氧化作用主要由變形菌綱中的AOB和奇古菌門中的AOA完成[10]。目前,有大量學(xué)者報(bào)道了河流底泥中AOA和AOB在硝化過(guò)程中的重要地位[11]。氨氧化功能微生物是水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要指示生物,也是水體自凈能力的標(biāo)志性微生物。贛江南昌段是南昌的主要飲用水源地,研究贛江南昌段豐、枯水期時(shí)空變化對(duì)底泥氨氧化微生物的影響,可作為水質(zhì)檢測(cè)的重要輔助手段[12],對(duì)南昌居民飲用水水質(zhì)安全及贛江南昌段水環(huán)境保護(hù)具有重要意義。本研究為探索贛江水體富營(yíng)養(yǎng)化和氮素循環(huán)過(guò)程提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

本研究在贛江南昌段枯、豐水期采取樣品,基于氨氧化微生物16S rDNA基因及功能基因的高通量測(cè)序技術(shù),探究了枯、豐水期贛江底泥中氨氧化微生物的豐度及群落結(jié)構(gòu),以及氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)特征變化及與環(huán)境因子間的響應(yīng)關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 采樣點(diǎn)分布及樣品采集

贛江流經(jīng)贛撫平原后貫穿南昌市,南昌市地形以鄱陽(yáng)湖平原為主,東南區(qū)域平坦,西北部為丘陵地段,贛江把南昌市劃分為“一江兩岸”的格局,流經(jīng)南昌市城區(qū)后分北支、中支、南支注入鄱陽(yáng)湖,北支流經(jīng)部分新城區(qū)和城郊農(nóng)業(yè)區(qū),南支環(huán)繞老城區(qū)及高新技術(shù)開發(fā)區(qū),中支主要流經(jīng)城郊農(nóng)業(yè)區(qū)[13]。流域內(nèi)氣溫變化大,為亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候,降水豐富但分布不均,豐、枯水期的區(qū)分較明顯。目前關(guān)于贛江南昌段水環(huán)境的研究主要基于野外采樣、統(tǒng)計(jì)年鑒或水質(zhì)模型分析水體污染程度。現(xiàn)有研究表明,贛江南昌段水質(zhì)總體較好,南支污染相對(duì)較重[14]。在閱讀相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)地調(diào)研[15-16]的基礎(chǔ)上,確定了贛江南昌段樣品的采集范圍,并沿途設(shè)置了5個(gè)采樣點(diǎn)(見(jiàn)圖1),于2019年12月(枯水期)和2020年7月(豐水期)采集,并將豐、枯水期樣品分別標(biāo)記為W1～W5、J1～J5。在采樣區(qū)0～20 cm取底泥,裝在經(jīng)過(guò)滅菌的自封袋中,帶回實(shí)驗(yàn)室在-20 ℃中保存供分子生物學(xué)分析,部分樣品保存于4 ℃以供后續(xù)理化性質(zhì)分析。

圖1 采樣區(qū)域地理位置及采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Geographic location of sampling area and sampling points diagram

1.2 材料與方法

1.2.1 理化性質(zhì)測(cè)定方法

每個(gè)底泥樣品環(huán)境指標(biāo)測(cè)定設(shè)置3個(gè)重復(fù)[17]。pH采用玻璃電極法測(cè)定,氨氮采用納氏試劑光度法測(cè)定,硝態(tài)氮采用離子色譜法測(cè)定,總氮采用半微量凱氏定氮法測(cè)定。以上的樣品采集、保存、運(yùn)輸和分析均按照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行。

1.2.2 脫氧核糖核酸(DNA)提取與高通量測(cè)序

采用NovaSeq PE250平臺(tái)對(duì)贛江底泥樣品進(jìn)行高通量測(cè)序,目標(biāo)基因及主要引物見(jiàn)表1,實(shí)驗(yàn)流程：DNA提取與檢測(cè)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、文庫(kù)制備與質(zhì)檢和上機(jī)測(cè)序。由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司對(duì)基因進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增子文庫(kù)大小由生物分析儀(AGJlent 2100)測(cè)定。

表1 贛江底泥氨氧化微生物的主要引物Table 1 The main primers involved in the experiment

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析和顯著性分析,微生物豐度及沉積物環(huán)境因子采用R語(yǔ)言進(jìn)行冗余分析,使用Origin 2019軟件進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 贛江南昌段底泥化學(xué)環(huán)境

由表2可見(jiàn),贛江枯水期底泥pH為6.51～7.94,總氮為0.59～1.43 g/kg,硝態(tài)氮為1.43～2.15 mg/kg,氨氮12.47～30.20 mg/kg;豐水期的pH為6.51～7.81,總氮為1.00～2.60 g/kg,硝態(tài)氮為2.72～35.29 mg/kg,氨氮為7.41～82.05 mg/kg。枯水期,J5的氨氮、硝態(tài)氮最高,J4的總氮最高;豐水期,W5的硝態(tài)氮、總氮最高,W2的氨氮含量最高。環(huán)境因子的變化規(guī)律表明,贛江水體和底泥理化性質(zhì)有明顯變化,這主要是受人類活動(dòng)的影響。

2.2 氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 氨氧化微生物群落多樣性和豐度分析

針對(duì)一個(gè)特定區(qū)域內(nèi)的生物群落多樣性,通常對(duì)其樣本中物種數(shù)量、豐度和均勻度,采用Alpha多樣性進(jìn)行分析,主要通過(guò)Observed OTUs、Chao1指數(shù)、樣本覆蓋率、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)等來(lái)反映物種豐富度、均勻性及測(cè)序深度。群落中豐度大于0的物種數(shù)之和,一般用Observed OTUs表示。Chao1指數(shù)主要反映樣本的物種豐富度信息。樣本覆蓋率越高,則樣本中新物種沒(méi)有被測(cè)出的概率越低,反映測(cè)序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況。辛普森和香農(nóng)指數(shù)主要綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度。香農(nóng)指數(shù)越大,表示不確定性越大,即這個(gè)群落中未知的因素越多,也就是多樣性越高。辛普森指數(shù)范圍為0～1,當(dāng)群里只有一種物種時(shí),辛普森指數(shù)最小為0,即多樣性最小;當(dāng)物種種類無(wú)限多,并且每個(gè)物種數(shù)目都一致(均勻度最高)時(shí),辛普森指數(shù)最大為1。基于功能基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序OTUs水平的AOA、AOB及Anammox群落多樣性見(jiàn)表3,其中J4樣品在Anammox群落結(jié)構(gòu)的Alpha多樣性質(zhì)檢不合格,不參與分析,因此在冗余分析中僅針對(duì)氨氮、總氮及pH進(jìn)行討論。枯、豐水期中樣本覆蓋率均為1.00,且辛普森指數(shù)接近于1,說(shuō)明能代表真實(shí)情況,且物種均勻度良好。

豐水期,AOA的Chao1、香農(nóng)指數(shù)均值分別為600.91、4.64;AOB的Chao1、香農(nóng)指數(shù)均值分別為788.21、4.35;Anammox的Chao1、香農(nóng)指數(shù)均值分別為408.26、4.25。枯水期,AOA的Chao1、香農(nóng)指數(shù)均值分別為871.64、5.11;AOB的Chao1、香農(nóng)指數(shù)均值分別為611.70、4.83;Anammox的Chao1、香農(nóng)指數(shù)均值分別為382.87、4.52。進(jìn)一步分析得到,豐水期時(shí)物種豐富度最大的為AOB,在枯水期時(shí)AOA更大,而物種多樣性在枯、豐水期時(shí)均為AOA大于AOB,而Anammox在枯、豐水期物種豐富度及多樣性都最小。

由表4可知,豐水期AOA共有2個(gè)菌屬,相對(duì)豐度均大于1%,其中亞硝化球菌屬相對(duì)豐度達(dá)98.18%,為優(yōu)勢(shì)菌屬;枯水期共有3個(gè)菌屬,其中亞硝化球菌屬相對(duì)豐度達(dá)98.33%,為優(yōu)勢(shì)菌屬。豐水期AOB共有5個(gè)菌屬,其中2個(gè)菌屬相對(duì)豐度大于1%,即亞硝化螺菌屬和亞硝化單胞菌屬;枯水期AOB群落均為變形菌門,共有2個(gè)菌屬,且相對(duì)豐度均大于1%,即亞硝化單胞菌屬和亞硝化螺菌屬。豐水期Anammox有4個(gè)菌屬,即Candidatusbrocadia、Candidatusjettenia、Candidatuskuenenia和Candidatusscalindua;枯水期有2個(gè)菌屬,即Candidatusbrocadia和Candidatusjettenia。

表2 枯、豐水期底泥的性質(zhì)1)Table 2 Properties of sediment samples in dry and wet seasons

表3 基于功能基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序OTUs水平的AOA、AOB及Anammox群落多樣性Table 3 Community diversity of AOA,AOB and Anammox based on high-throughput sequencing of functional gene amplicons at OTUs level

表4 枯、豐水期AOA、AOB、Anammox的樣品相對(duì)豐度(屬水平)Table 4 Relative abundance of AOA,AOB and Anammox in dry and wet seasons (genus level)

2.2.2 氨氧化微生物群落與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

枯、豐水期AOA、AOB、Anammox的冗余分析見(jiàn)圖2,其中第一冗余分析組分(RDA1)和第二冗余分析組分(RDA2)分別解釋了贛江南昌段在枯、豐水期氨氧化微生物群落組成的總變異量。

豐水期,AOA中RDA1和RDA2分別為99.40%和0.60%,結(jié)果可在一定程度上解釋細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的聯(lián)系。5個(gè)采樣點(diǎn)分布在4個(gè)象限中,說(shuō)明5個(gè)采樣點(diǎn)的理化性質(zhì)變化較明顯。亞硝化球菌屬與pH、硝態(tài)氮、總氮呈正相關(guān),與氨氮呈負(fù)相關(guān);Candidatusnitrosocosmicus與總氮、pH、硝態(tài)氮呈負(fù)相關(guān),與氨氮呈正相關(guān)。進(jìn)一步分析可知,總氮與豐水期底泥的AOA群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性較大,是豐水期AOA群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵影響因子。枯水期,RDA1和RDA2的貢獻(xiàn)值分別為52.24%和39.62%,可在一定程度上解釋細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的聯(lián)系。5個(gè)采樣點(diǎn)在3個(gè)象限中,說(shuō)明5個(gè)采樣點(diǎn)的理化性質(zhì)存在一定的變化。亞硝化球菌屬與氨氮、pH、硝態(tài)氮呈正相關(guān)，與總氮呈負(fù)相關(guān)；而Candidatusnitrosocaldus與氨氮呈正相關(guān)，與其他環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)。總氮在4個(gè)環(huán)境因子中與枯水期底泥AOA群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性較大,是枯水期AOA群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵影響因子。

圖2 枯、豐水期AOA、AOB、Anammox的冗余分析Fig.2 Redundancy analysis of AOA,AOB and Anammox in dry and wet seasons

豐水期,AOB中RDA1和RDA2貢獻(xiàn)值分別為96.63%和3.37%,結(jié)果可較好解釋細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的聯(lián)系。5個(gè)采樣點(diǎn)分布在3個(gè)象限中,其中亞硝化螺菌屬與4個(gè)環(huán)境因子呈正相關(guān)，亞硝化單胞菌屬與4個(gè)環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)。其優(yōu)勢(shì)屬為亞硝化單胞菌屬,總氮與氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較大,是豐水期AOB群落結(jié)構(gòu)關(guān)鍵影響因子。枯水期,RDA1和RDA2的貢獻(xiàn)值分別為60.95%和39.05%,結(jié)果可在一定程度上解釋細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的聯(lián)系。5個(gè)采樣點(diǎn)分布在3個(gè)象限中。亞硝化單胞菌屬與硝態(tài)氮呈正相關(guān),與總氮、氨氮、pH呈負(fù)相關(guān);亞硝化螺菌屬與氨氮、pH呈正相關(guān),與總氮、硝態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)。優(yōu)勢(shì)屬為亞硝化單胞菌屬,總氮是枯水期AOB群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵影響因子。

豐水期,Anammox中RDA1和RDA2的貢獻(xiàn)值分別為69.28%和30.72%。其中氨氮、pH在4個(gè)環(huán)境因子中與Anammox群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性較大,是豐水期的關(guān)鍵影響因子。Candidatusbrocadia與氨氮呈負(fù)相關(guān),與pH、硝態(tài)氮、總氮呈正相關(guān);Candidatuskuenenia與氨氮、硝態(tài)氮、總氮呈正相關(guān),與pH呈負(fù)相關(guān)。Candidatusbrocadia為優(yōu)勢(shì)屬。枯水期,RDA1和RDA2的貢獻(xiàn)值分別為99.88%和0.12%。總氮與枯水期Anammox群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性較大,是Anammox群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵影響因子。Candidatusbrocadia與pH呈正相關(guān),與氨氮、總氮呈負(fù)相關(guān),而Candidatusjettenia則相反。Candidatusbrocadia為優(yōu)勢(shì)屬。

3 討 論

(1) 受人類活動(dòng)的影響,贛江北支與南支污染程度較嚴(yán)重,贛江分支口以及中支相對(duì)較好,底泥豐水期中各物質(zhì)濃度高于枯水期。針對(duì)底泥重金屬含量進(jìn)行分析,結(jié)果表明,含量未超過(guò)江西省背景值,枯、豐水期差異較小,與李鳳果[23]研究一致,且發(fā)現(xiàn)低濃度重金屬含量對(duì)氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)影響較小[24],因此在本研究中未展開討論。

(2) 豐、枯水期微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一定變化,底泥微生物群落結(jié)構(gòu)受到河流污染的影響。贛江底泥枯水期的Chao1指數(shù)顯示的物種豐富度順序?yàn)锳OA>AOB>Anammox,而豐水期為AOB>AOA>Anammox。本研究枯水期各物種豐度與CAO等[25]對(duì)珠江流域、鄒雨璇等[26]對(duì)黃河故道等一些淡水生態(tài)系統(tǒng)中底泥的研究結(jié)果一致;此外,在紅樹林[27]、鎮(zhèn)江[28]、青海湖[29]底泥中也證實(shí)豐水期時(shí),AOB的豐度大于AOA。根據(jù)香農(nóng)指數(shù),枯、豐水期的物種多樣性排序均為AOA>AOB>Anammox。這表明不同時(shí)期贛江底泥中氨氧化微生物的主要類群不同。

(3) AOB群落在豐、枯水期時(shí)其優(yōu)勢(shì)屬都為亞硝化單胞菌屬,這與研究者們?cè)诘疂竦丨h(huán)境研究中得到的結(jié)果相同[30],且有研究表明,枯水期時(shí),亞硝化單胞菌屬偏向于低氨氮環(huán)境,而亞硝化螺菌屬更適應(yīng)高氨氮的污染環(huán)境[31]。研究結(jié)果顯示,亞硝化單胞菌屬含量更多,這表明贛江底泥環(huán)境中為低氨氮環(huán)境。豐水期時(shí),AOA有亞硝化球菌屬和Candidatusnitrosocosmicus,其主要類群為亞硝化球菌屬。BOLLMANN等[32]研究表明,高營(yíng)養(yǎng)湖泊沉積物中的AOA群落以亞硝化球菌屬為主。這表明,贛江底泥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度較高。AOA群落在枯水期有3個(gè)屬(亞硝化球菌屬、Candidatusnitrosocosmicus和Candidatusnitrosocaldus)。Anammox群落在枯水期有2個(gè)屬群(Candidatusbrocadia和Candidatusjettenia);豐水期有4個(gè)屬,其主要類群為Candidatusbrocadia,研究表明,該菌屬具有高生長(zhǎng)速率和低底物親和力,在黃河水體、土壤中均存在。

(4) 不同時(shí)期AOA、AOB、Anammox群落結(jié)構(gòu)不相同且關(guān)鍵影響因子不相同,枯、豐水期AOB群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵影響因子都為總氮,與其關(guān)鍵屬亞硝化單胞菌屬均呈負(fù)相關(guān)。有研究表明,AOB群落結(jié)構(gòu)易受到底泥環(huán)境的影響[33]。AOA群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵影響因子均為總氮,其關(guān)鍵屬亞硝化球菌屬與總氮在枯、豐水期分別呈負(fù)、正相關(guān)。SIMS等[34]研究同樣表明AOA群落結(jié)構(gòu)與總氮等濃度密切相關(guān)。枯水期Anammox群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵影響因子為總氮,其關(guān)鍵屬Candidatusbrocadia與總氮呈負(fù)相關(guān);豐水期的關(guān)鍵影響因子為pH和氨氮,其關(guān)鍵屬Candidatusbrocadia與pH正相關(guān),與氨氮呈負(fù)相關(guān)。研究表明,Anammox群落結(jié)構(gòu)和活性會(huì)受到pH的影響[35],與本研究結(jié)果一致,也表明了脫氮功能微生物對(duì)氮循環(huán)作用的貢獻(xiàn)與環(huán)境因子是密切相關(guān)的。

4 結(jié) 論

(1) 豐、枯水期微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一定變化,底泥微生物群落結(jié)構(gòu)受到河流污染的影響。脫氮功能微生物在枯、豐水期的群落多樣性排序?yàn)锳OA>AOB>Anammox,物種豐富度枯水期為AOA>AOB>Anammox、豐水期為AOB>AOA>Anammox。不同時(shí)期贛江底泥中氨氧化微生物的主要類群不同。

(2) 不同時(shí)期,AOA、AOB、Anammox的優(yōu)勢(shì)屬都分別為亞硝化球菌屬、亞硝化單胞菌屬、Candidatusbrocadia。

(3) 總氮是豐、枯水期AOA、AOB群落結(jié)構(gòu)及枯水期Anammox群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵影響因子;pH和氨氮為豐水期Anammox群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵影響因子。