參附注射液治療急性心力衰竭的網絡藥理學研究*

張紫嫣 韋岳昆 傅 永 李陳星 黃代政

（廣西醫科大學，廣西 南寧 530021）

急性心力衰竭（AHF）是指由心臟功能異常導致的心衰癥狀和體征突然發作或迅速加重的急性綜合征。因其起病急、可危及生命、預后差、住院病死率高等特點，已成為臨床最嚴重常見急癥之一［1］。目前，AHF的常規治療包括血管緊張素轉換酶抑制劑、利尿劑、血管緊張素受體腎上腺素抑制劑、洋地黃、β受體阻滯劑等。雖然這些藥物可取得一定的治療效果，但持續成本高、療效短，醫療負擔仍然不斷增加［2］。研究表明［3］，中西醫結合治療AHF具有良好的效果。中醫學認為，AHF的常見證型為陽氣虛衰、血瘀水滯。參附注射液（參附注射液）具有回陽救逆、益氣固脫的作用，能補陽固氣，增強心肌收縮力，保護心肌，改善血流動力學指標并調節心率［4］，常用于AHF的中西醫結合急救。中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點。本文應用網絡藥理學研究方法，分析參附注射液主要成分，找出參附注射液和AHF的共同靶點，從靶點、生物過程、通路的角度探究參附注射液治療AHF的作用機制，為臨床和科研提供參考。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分及相關靶點獲取 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中分別輸入參附注射液的主要成分“紅參”“附子”進行搜索，根據TCMSP網站上提供的信息與已發表的文獻［5］，設置ADME屬性值“口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18”為篩選條件，搜索這兩個藥物的有效化合物。鑒于以“紅參”“附子”進行搜索得到的結果具有匹配靶點較少，與疾病靶點的相交部分僅有9項，且其間相關太低，不足以建立PPI網絡。故本研究考慮使用“人參”替代“紅參”進行搜索，篩選條件仍同前。

1.2 疾病靶點獲取 以“Acute heart failure”為關鍵詞，在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）和Therapeutic Target Database藥物靶標數據庫（TTD數據庫，http：//db.idrblab.net/ttd/）中進行搜索。

1.3 疾病與藥物靶點交集及網絡構建 將獲取到的參附注射液靶點和AHF靶點分別經Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）進行統一，經Excel整理刪除重復值，得到相應靶點的基因名。使用R軟件（版本4.1.3）對數據進行統計分析后，利用VennDiagram包對結果進行可視化，得到疾病與藥物的共同靶點和Venn圖。將共同靶點導入蛋白質互作數據庫STRING（https：//string-db.org/）設置物種為“Homo sapiens”進行分析，構建藥物-疾病靶點蛋白互作（PPI）網絡圖，系統分析靶點蛋白在生物系統中的相互作用關系，以期了解系統中蛋白質的工作原理、疾病等特殊生理狀態中生物信號和能量物質代謝的反應機制及蛋白之間的功能聯系。

1.4 富集分析及可視化 使用R軟件的Cluster Profiler包、org.Hs eg.db包等對共同靶點進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。篩選出P-value＜0.05的結果，并使用Ggplot2包對其結果進行可視化。分別將GO富集分析結果，包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）繪制成柱狀圖，將KEGG通路富集分析結果繪制成氣泡圖，以期了解參附注射液治療AHF的機制。

2 結 果

2.1 參附注射液有效成分及相關靶點獲取 本研究在TCMSP數據庫設置ADME屬性值“OB值≥30%和DL值≥0.18”為篩選條件，以“人參”和“附子”為搜索關鍵詞，篩選有對應靶點的化合物后，得到有效成分24個，如表1所示。包括水黃皮素（Karanjin）、人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2）、人參皂苷Rh4_qt（Ginsenoside Rh4_qt）、谷甾醇（Sitosterol）等。對應到共計281個靶點，經Uniprot數據庫標準化、刪除重復值等處理后得到共104個基因。

表1 參附注射液中有效成分

2.2 AHF疾病靶點和藥物-疾病共同靶點的獲取 整合在Genecard數據庫和TTD數據庫中以“Acute Heart Failure”為關鍵詞搜索到的內容，得到10 110個靶點。根據經驗，篩選Genecard數據庫中Relation score大于等于中位數的值為異常潛在靶點，得到5 056個靶點。經Uniprot數據庫標準化后得到相應基因共4 818個，以“Reviewed”和 Popular organisms-“Human”為篩選條件過濾掉未認證的和非人源的基因，得到基因共4 790個。經過Excel“刪除重復值處理”后，得到基因共4 744個。通過R軟件進行統計分析與可視化，得到參附注射液-AHF共同靶點81個，如圖1所示。

圖1 參附注射液-AHF共同靶點Venn圖

2.3 疾病與藥物靶點交集及網絡構建 將“2.2”中得到的共同靶點導入STRING網站，得到參附注射液-AHF的PPI圖，如圖2所示。圖中含有80個靶點，和502條互作邊。其中1個節點表示1個共同靶點即蛋白，互作邊表示靶點間的作用關系。鑒于真核生物的可變剪切與轉錄后修飾，1個蛋白編碼基因可能會產生出多個蛋白，PPI圖上將由同一個基因產生的不同isoform進行了合并，在節點上標記的字母實際為編碼該蛋白的基因名。PPI圖上互作邊中，各色連線分別表示連接的兩者關系如下：綠色——在彼此的基因組鄰域中經常觀察到的關系；紅色——融合關系；藍色——同現關系；黃色——文本挖掘關系；黑色——共表達關系；紫色——同源蛋白質；湖藍色連線——來自精選數據庫的關系；粉紫色——經實驗確認的關系。越是處在PPI中心區域、與其他節點互作邊越多的靶點，其在疾病中的重要性越高。導出結果，統計各個靶點與其他靶點相連的節點數，得到連接節點數最多的前10位是AKT1（與44個靶點相關）、TNF（與41個靶點相關）、IL-1β（與36個靶點相關）、PTGS2（與34個靶點相關）、PPARG（與33個靶點相關）、CASP3（與30個靶點相關）、NOS3（與26個靶點相關）、HMOX1（與25個靶點相關）、ICAM1（與24個靶點相關）、RELA（與23個靶點相關）。筆者推測這些靶點可能是參附注射液治療AHF的核心靶點。

圖2 參附注射液-AHF PPI圖

2.4 富集分析結果及可視化 使用R軟件的clusterprofiler包和org.Hs.eg.db包，對共同靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析。刪除結果中P值＞0.05的部分，得到具有統計學意義的結果BP 315個，CC 46個，MF 76個，KEGG 118條通路。根據GO分析的結果中富集到的基因數（Counts）從大到小排序，選擇BP、CC、MF各組的前10個結果，使用Ggplot2包進行可視化作柱狀圖，如圖3所示。其中與AHF最為相關的生物過程為信號轉導（Signal transduction）、RNA聚合酶IF啟動子（RNA polymerase if promoter）、正向調節及轉錄（Positive regulation，of transcription from）、藥物反應（Response to drug）；最為相關的細胞成分為質膜（Plasma membrane）、胞漿（Cytosol）、胞質（Cytoplasm）、膜整體組分（Integral component of membrane）；最為相關的分子功能為蛋白質結合（Protein binding）、相同的蛋白質結合（Identical protein binding）、酶結合（Enzyme binding）、蛋白質同聚活性（Protein homodimerization activity）。

圖3 GO富集分析結果

在KEGG分析的結果中，篩選出P值＜0.05的結果，并按照P值從小到大排序，選擇前20的值進行可視化作氣泡圖，如圖4所示。共同靶點主要富集于腫瘤通路（Pathways in cancer）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、cGMP-PKG信號通路（cGMP-PKG sig-naling pathway）、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、C型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、NF-κB信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）等相關信號通路，同時與脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、甲型流感（Influenza A）、弓形蟲病（Toxoplasmosis）、肺結核（Tuberculosis）、麻疹（Measles）、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、丙型肝炎（Hepatitis C）、乙型肝炎（Hepatitis B）、小細胞肺癌（Small cell lung cancer）、化學致癌-受體激活（Chemical carcinogenesisreceptor activation）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）等疾病存在關系。

圖4 KEGG通路富集分析結果

3 討 論

AHF為臨床最常見的急危重癥之一，具有較高的發病率和病死率，嚴重危害生命安全，其主要病因和致病機制為血流動力學障礙。本癥急救藥物應用以強心、利尿、糾正血流動力學狀態、針對病因治療為主，中西醫結合有更好的療效。中藥注射劑與傳統中藥湯劑相比，其有效成分可以通過靜脈注射的方式直接注入血液，藥物不會被消化系統代謝，從而保證有足夠的有效成分發揮作用。研究表明，參附注射液主要有效成分為烏頭類生物堿和人參皂苷［6-8］，具有強心作用，可增加心排出量、改善心肌缺血狀況；在提高平均動脈血壓、正常化心率、清除血清乳酸、降低死亡率方面比傳統的治療方法更高效［9］。參附注射液還具有清除自由基、抑制炎癥介質、抑制細胞凋亡和調節宿主免疫應答等多種作用［10-11］。因此，參附注射液在20世紀90年代即被列為“全國中醫醫院急診科室必備中成藥”，在AHF的防治方面發揮了良好作用，進一步探尋其作用機制很有必要。

本研究利用網絡藥理學方法探究參附注射液對AHF的作用機制。通過TCMSP篩選出參附注射液對應靶點的有效成分24個，包括穿心蓮內酯、豆甾醇、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2、人參二醇、人參皂苷-Rh4_qt等。藥理學研究［12-13］表明，人參皂苷的作用有：1）改善缺血心肌代謝、增強心肌收縮力、增加心排出量；2）清除自由基、保護心肌超微結構；3）阻滯細胞膜鈣離子通道，減少鈣離子超載，從而減輕心肌損傷；4）增強前列腺素的合成和釋放，改善微循環與冠脈血流。豆甾醇可以降低氧化應激［14］。山柰酚可以導致膜超極化，達到擴張血管的作用［15］。穿心蓮內酯能夠抑制糖酵解，恢復線粒體氧化磷酸化，促進細胞氧化供能［16］。β-谷甾醇具有較強的清除活性氧自由基能力［17］。這些藥物有效成分的生物功能均與AHF機制相關，筆者由此推斷這些有效成分可以共同作用于AHF，起到治療作用。

通過對參附注射液的24個有效成分對應的靶點和AHF的靶點取交集和篩選處理后，得到81個參附注射液-AHF共同靶點。利用STRING工具構造PPI圖，得到與其他蛋白互作最多的前10位是Akt1、TNF、IL1B、PTGS2、PPARG、CASP3、NOS3、HMOX1、ICAM1、RELA。將以上結果在轉化醫學網（https：//www.360zhyx.com/）上進行搜索，得到結果如下：AKT1調節許多細胞過程，包括代謝、增殖、細胞生長、血管生成和抗細胞凋亡；同樣參與調節細胞凋亡的還有CASP3、PTGS2、RELA、IL-1β；參與調節細胞代謝的還有TNF、NOS3；參與氧化還原的還有PPARG、HMOX1、PTGS2。這些靶點所參與心肌活動關系密切，由此筆者推測參附注射液通過作用于以上靶點，達到對AHF的治療作用。

通過對GO富集結果分析，可知“2.4”所得到的生物過程、細胞成分、分子功能結果均與心肌做功相關，筆者推測這些結果可能會對血流動力學產生影響，與AHF的疾病機制密切相關。通過分析KEGG結果，可知共同靶點主要富集于鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、C型凝集素受體信號通路、NF-κB信號通路、IL-17信號通路等相關信號通路。心肌屬于平滑肌，鈣是影響平滑肌收縮功能的重要因素，由此可知鈣信號通路與AHF密切相關。研究表明，cGMP-PKG信號通路在臨床上是保留射血分數心衰的一個治療靶點，激活cGMP-PKG轉導在動物模型中有心臟保護作用［18］。TNF信號通路受競爭性的泛素結合和去泛素化控制，從而控制蛋白酶體降解和去泛素化［19］。C型凝集素受體信號通路參與免疫應答［20］。NF-κB通路對涉及的各種外部刺激作出炎癥反應、免疫反應，調節細胞的增殖、分化和生存活動［21］。IL-17信號通路在炎癥反應中起著重要的作用［22］。筆者推測參附注射液通過對以上通路進行調節，提高AHF心肌做功，從而改善患者的血流動力，以達到對AHF的臨床救治效果。

本研究從網絡藥理學的角度探討參附注射液治療AHF的作用機制，認為參附注射液的有效成分可對AHF疾病靶點進行代謝、增殖、細胞生長、血管生成和抗細胞凋亡生理活動調節，具有改善缺血心肌代謝、增強心肌收縮力、增加心排出量、清除自由基、保護心肌超微結構、減輕心肌損傷、改善微循環與冠脈血流、降低氧化應激、擴張血管作用、促進細胞氧化供能、清除活性氧自由基等能力。綜上所述，參附注射液對AHF的治療有多成分、多靶點、多通路的特征。

本研究的不足之處是，鑒于臨床上AHF主要表現為中醫學之“陽氣虛衰、血瘀水停”證，其他證型不多，故僅從網絡藥理學的角度整體探尋參附注射液對AHF的作用機制，未對AHF進行辨證分型、討論。為了更深入研究參附注射液對AHF的作用機制，筆者考慮下一步將對AHF進行辨證論治，使用的不同藥物進行中醫復方網絡藥理學研究，為臨床工作和科學研究提供參考。