外泌體在肝癌耐藥中的研究進展

2022-11-24 06:34:19張堯雨楊淑琳綜述宋小天審校

河北醫科大學學報 2022年8期

張堯雨，楊淑琳(綜述)，魏林，宋小天(審校)

(河北醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，河北石家莊 050017)

原發性肝癌(primary liver cancer，PLC)是世界范圍內發病率排名第六，病死率排名第三的惡性腫瘤。肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發性肝癌最常見的類型，占75%～85%[1-2]。近年來，分子靶向藥物和免疫療法在肝癌治療上取得了快速進展，但由于復發和遠處轉移以及對抗腫瘤藥物的耐藥性，肝癌患者的五年總生存率仍不容樂觀[3]。外泌體作為細胞間信息交流的重要媒介，與腫瘤的發生發展及耐藥性密切相關。現就外泌體在肝癌耐藥中的作用方式進行闡述，以深入探討肝癌耐藥的相關機制，對指導臨床合理用藥及尋找新的干預措施具有重要的指導意義。

1 外泌體的發現

外泌體是由細胞通過多囊泡體與細胞膜融合而分泌的40～200 nm的膜包裹囊泡，最初在綿羊網織紅細胞中被發現，后來被命名為外泌體。外泌體來源于幾乎所有類型的細胞，并存在于各種體液中，其功能也依賴于來源的細胞類型。TSG101、分化抗原(cluster of differentiation，CD)81、CD63、CD9是其表面的特異性標記物[4-5]。近年來由于其在細胞間信息交流、信號轉導、免疫調節和藥物傳遞等方面的作用而備受關注[6]。目前，外泌體的分離方法有差速超速離心法、磁珠分離法、微流體法、超濾法、尺寸排阻色譜法、聚合物沉淀法等。差速超速離心法是外泌體分離方法的“金標準”，但該方法需要昂貴的儀器，且獲得的外泌體濃度和純度較低。外泌體含有多種生物活性分子，包括核酸、蛋白質和脂質等，這些信息物質可以包裹在外泌體中被細胞分泌到微環境中。受體細胞可以通過直接融合、內吞或直接與其表面標志物融合攝取外泌體，通過其攜帶的信息物質調節受體細胞的生物學活性，從而參與機體免疫應答、免疫調節、腫瘤侵襲和藥物傳遞等生物學過程[7]。

2 外泌體與肝癌的發生發展

從“種子與土壤”假說到今天，人們對腫瘤的研究不僅局限于腫瘤細胞本身，而是更加關注于腫瘤細胞所處的微環境。腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)是高度異質性的，在功能失調的環境(缺氧等條件)下，可導致血管網絡和信號通路異常，TME中的細胞通過細胞間連接、自分泌和旁分泌相互作用進而促進腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥[8]。其中，旁分泌因子包括細胞因子(cytokines，CK)、趨化因子(chemokines)和外泌體，現在被認為是占主導地位的生物因子。近年來，多項研究發現外泌體在促進肝癌發生發展中具有重要作用[9]。研究表明，許多的外泌體非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)參與了肝癌進展過程，非編碼RNA是指不編碼蛋白質的RNA，如微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、環狀RNA(circular RNA,circRNA)等。比如肝癌細胞分泌的miR-103可以靶向多個內皮連接蛋白，增加血管通透性，促進腫瘤轉移[10]。腫瘤相關成纖維細胞外泌體miR-320a的缺失與肝癌的增殖和轉移密切相關[11]。高轉移性肝癌細胞分泌外泌體miR-1247-3p，直接靶向B4GALT3蛋白，導致成纖維細胞中整合素β1-NF-κB信號通路激活，激活的腫瘤相關成纖維細胞通過分泌白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)等促炎細胞因子，促進肝癌進展及轉移[12]。外泌體是上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的重要介質，可將癌細胞轉化為更具侵襲性的表型。肝癌細胞來源的外泌體miR92a-3p通過抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)和激活Akt/Snail信號通路在促進EMT進展和肝癌轉移中起著關鍵作用[13]。外泌體也可通過介導免疫抑制環境來促進腫瘤進展。例如肝癌細胞分泌外泌體賴氨酰氧化酶樣蛋白4(recombinant lysyl oxidase like protein 4，LOXL4)，一方面可以招募更多的浸潤的巨噬細胞，另一方面，可以調節巨噬細胞呈遞抑制性檢查點分子細胞程序性死亡-配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)，削弱細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導的免疫監視，促進腫瘤細胞的免疫逃避，導致肝癌的發生[14]。

3 外泌體與肝癌耐藥

傳統上，腫瘤耐藥機制包括腫瘤細胞中抗凋亡蛋白的過度表達、藥物外排泵的過度表達、藥物作用靶點的突變、信號通路改變等。肝癌是實體瘤中最典型的耐藥腫瘤，可過表達二氫嘧啶脫氫酶、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)基因。除了這些已被充分研究的機制外，外泌體誘導的腫瘤耐藥已成為一種新的機制被研究者們廣泛關注[15]。大量研究表明，外泌體可抵抗許多分子靶向藥物和免疫治療方案，包括索拉非尼，免疫檢查點抑制劑、免疫檢查點抑制劑聯合靶向治療等。索拉非尼是美國食品藥品監督管理局(Food And Drug Administration,FDA)批準的第一個用于治療晚期肝癌的一線藥物，是一種作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶和受體酪氨酸激酶的多激酶抑制劑。免疫檢查點抑制劑是免疫療法中應用最為廣泛的方法，主要分為兩大類，一類是以程序性死亡受體1(programmed cell death protein1，PD-1)為代表的抑制劑，另一類是激活劑，激活劑目前還處于臨床研究階段。

外泌體中藥物外排泵的存在與耐藥密切相關，可能是外泌體中存在的P-gp和ATP結合盒蛋白(ATP-binding cassette protein，ABC protein)轉運體家族成員介導藥物在這些小泡中主動隔離。ABC轉運體家族成員的過度表達曾被廣泛認為是腫瘤細胞多藥耐藥的重要因素，其介導的藥物外排泵作用是腫瘤發生耐藥的重要原因之一。有人認為，藥物刺激可促進外泌體的產生從而加速藥物外排，或許會成為一種新的耐藥機制。外泌體可能通過調節ABC轉運體家族成員的表達而促進肝癌耐藥。研究表明，在索拉非尼、喜樹堿和阿霉素等抗腫瘤藥物作用下，肝癌細胞來源的外泌體高表達lnc-VLDLR，顯著上調ABCG2(ATP結合盒、G亞家族成員2)的表達，從而加快藥物外排、消除肝癌細胞的藥物反應和敏感性導致耐藥[16]。另外，耐藥細胞中的某些物質可通過外泌體轉移至藥物敏感(受體)細胞，使其獲得多藥耐藥的表型。例如外泌體circRNA-SORE和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)。研究認為circRNA-SORE通過外泌體促進肝癌細胞對索拉非尼耐藥[17]。circRNA-SORE在索拉非尼耐藥肝癌細胞中表達上調，藥物敏感細胞在過表達circRNA-SORE后也獲得了耐藥性。沉默circRNA-SORE則可以顯著增強藥物誘導的腫瘤細胞凋亡。另一項研究顯示，高度侵襲性肝癌細胞來源的外泌體可誘導其他肝癌細胞產生索拉非尼耐藥性[18]。其機制是外泌體中HGF增多，通過激活HGF/c-Met/Akt途徑抑制細胞凋亡，促進腫瘤生長，進而促進肝癌細胞對索拉非尼耐藥。

雖然EMT被公認為是癌癥轉移的關鍵介質，但最近的研究顯示，其對于腫瘤的治療耐藥性也是至關重要的。目前EMT促進耐藥性的詳細機制尚不清楚，但可能歸因于間充質狀態、特定轉錄因子和相關信號級聯的失調等。對于耐藥性的影響，最近的一項研究表明，耐藥肝癌細胞分泌的外泌體以EMT依賴的方式“培養”敏感細胞成為多藥耐藥細胞[19]。來自耐藥肝癌細胞的外泌體可以將致癌的miR-32-5p轉移至藥物敏感細胞，導致藥物敏感細胞中PTEN水平顯著降低，從而觸發PI3K/Akt/mTOR通路的激活，并通過調節血管生成和EMT誘導多藥耐藥(5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、吉西他濱和索拉非尼)的發生。然而，持續使用外泌體分泌抑制劑GW4869，導致外泌體miR-32-5p減少，EMT逆轉，最終抑制了5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、吉西他濱和索拉非尼的耐藥性。此進一步確定了肝癌組織中外泌體miR-32-5p水平與EMT發生耐藥的相關性。

腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)是肝癌細胞的一個亞群，具有很強的自我更新、分化和成瘤能力。越來越多的證據表明，干細胞對肝癌的許多治療手段都具有抗性。干細胞的干性相關基因，包括上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、CD133、CD90等在耐藥肝癌細胞中高度表達。因此，干細胞被認為是促成肝癌耐藥性的關鍵因素。基于此，TME中的外泌體內容物可以通過引發干細胞特性來參與治療耐藥。對于肝細胞癌，索拉非尼治療的肝癌細胞和轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)均可以富集外泌體lnc-ROR，一方面通過抑制抑癌基因p53依賴的信號轉導途徑誘導耐藥，另一方面通過擴增CD133+干細胞群減少索拉非尼誘導的肝癌細胞死亡。進一步敲低lnc-ROR則可增強索拉非尼誘導的肝癌細胞死亡，同時減少了 CD133+的干細胞，這些結果表明外泌體lnc-ROR是驅動肝癌干細胞誘導治療耐藥性的基礎[20]。

免疫治療被認為是晚期肝癌的一種有前途的治療方法，但仍有相當比例肝癌患者無反應甚至出現耐藥。外泌體除了在肝癌的靶向藥物治療中參與耐藥的發生，其在免疫治療中也存在著促進耐藥的現象。最近一項研究表明外泌體circUHRF1可促進肝癌的免疫逃逸(immune evasion)，阻斷PD-1抗體治療[21]。其原因可能是肝癌細胞來源的外泌體circUHRF1抑制了自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)細胞來源的干擾素γ(interferon-gamma，IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)的分泌。此外，circUHRF1也可通過降解miR-449c-5p上調T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3)的表達，抑制NK的殺傷功能，從而促進肝癌的免疫逃逸和對PD-1抗體治療的抵抗。因此，抑制circUHRF1有可能成為肝癌患者的治療靶點。

4 外泌體在肝癌耐藥治療中的作用

目前，常用的藥物遞送系統有脂質體和聚合物納米顆粒(nanoparticles，NPs)。這兩種給藥系統已被用于遞送不同類型的藥物分子，包括抗癌藥物、抗真菌藥物和鎮痛藥等。然而，脂質體制劑因無法承受剪切壓力、溫度、酸堿度或稀釋劑濃度的變化，且無法精確地輸送到體內的特定位置限制了它的使用[22]。聚合物納米顆粒比脂質體系統具有更好的穩定性，但它們的生物相容性和潛在的安全性仍有待進一步研究。隨著外泌體的深入研究，人們發現外泌體或外泌體模擬物擁有高效的貨物運輸功能，具有理想藥物傳遞系統的許多特征，如循環半衰期長、靶向組織能力強、生物相容性好，沒有內在毒性等。這似乎是一種更好的選擇，能克服大多數脂質體或聚合物藥物傳遞系統的局限性。許多文獻表明，外泌體給藥系統可以應用到腫瘤的治療中[23-24]。

眾所周知，干細胞療法已用于治療或預防疾病多年。在已上市的干細胞產品中應用最多的就是間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)。并且在已知的產生外泌體的細胞類型中，人類間充質干細胞是產量最高的細胞。最近一項研究表明將miR-122包裹到脂肪組織來源的間充質干細胞分泌的外泌體中，通過誘導細胞凋亡和細胞周期停滯有效地增強了肝癌的治療敏感性[25]。此外，瘤內注射外泌體miR-122可顯著增強索拉非尼對肝癌的體內抗腫瘤作用，這為肝癌患者的治療提供了新的策略。同樣，siGRP78修飾的骨髓間充質干細胞外泌體能敏化索拉非尼耐藥的肝癌細胞，抑制細胞外基質的降解，進而抑制腫瘤的進展，并逆轉其耐藥性。并且外泌體siGRP78在體內外均可以抑制肝癌生長和侵襲[26]。也有越來越多的證據表明，外泌性miRNA參與肝癌耐藥治療。如Wang等[27]用富含miR-744的外泌體處理肝癌細胞，通過抑制PAX2蛋白的表達抑制了肝癌細胞的增殖，并增強了肝癌細胞對索拉非尼治療的敏感性。Semaan等[28]用富含miR-214的人腦內皮細胞衍生的外泌體聯合抗癌劑(奧沙利鉑或索拉非尼)治療肝癌，與單獨使用抗癌劑相比，顯著降低了肝癌細胞的生存力和侵襲力，其機制是miR-214降低了肝癌細胞P-gp蛋白和SF3B3蛋白的表達，P-gp和SF3B3是廣為人知的可以促進肝癌化療耐藥性和癌細胞增殖的兩種蛋白。該聯合治療對肝癌細胞具有靶向性，機體內正常組織和細胞不受影響。之前的研究報道過，索拉非尼誘導耐藥是通過增強PD-L1的表達和調節性T細胞(regulatory cells，Tregs)的比例，進一步在原位肝癌模型中誘導了免疫抑制。最近有研究表示外泌體聯合免疫療法可以增強索拉非尼的療效。這是由于外泌體減少了Tregs的數量，增加了CTL細胞的數量，但單獨使用外泌體或PD-1抗體則效果不明顯[29]。

由于外泌體介導了肝癌治療耐藥，因此可能會成為預測肝癌耐藥的一種潛在的非侵入性生物標志物。肝癌患者血清中存在著許多外泌體miRNA、lncRNA、circRNA，可通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)或酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)進行定量檢測，對治療反應較差的肝癌患者有較好的臨床應用前景。通過抑制外泌體的生物發生或抑制外泌體輸出抗藥性物質是可行的。盡管外泌體在肝癌方面的相關工作較少，但已經在其他腫瘤開展了下一步的研究。靶向外泌體極有可能是逆轉肝癌耐藥性的一項候選策略。

5 展望