馬的胚胎移植技術研究

李文芳，周聰杰，陶金良，張 翔

（1.東方馬都（天津）有限公司，天津 301700；2.中國農業大學 動物科技學院，北京 100193）

胚胎移植（embryo transfer）是將體內、外生產的哺乳動物早期胚胎移植到同種的生理狀態相同的雌性生殖道內，使之繼續發育為正常個體的生物技術。運用胚胎移植技術可將供體母馬的優良品質較快、較多地遺傳給后代。

1 發展簡史與實踐價值

1.1 發展簡史

胚胎移植最早是1890年在兔子上試驗成功的，此后山羊、大鼠、綿羊、小鼠、奶牛、豬等胚胎移植后代相繼問世。1977年該技術開始應用于生產，至今發達國家已經進入商業化應用階段。

馬屬動物首次胚胎移植成功是1972年由Allen&Rowson報道的，他們于1971年在英國劍橋的動物研究所將馬、驢、騾的胚胎從供體輸卵管中收集并手術移植到19例受體的子宮中，獲4例妊娠的結果。同年，日本人Oguri&Tsutsumi報道用非手術法由子宮沖卵收集胚胎并移植而未獲成功。1974年他們經過整個子宮沖胚獲得90%的胚胎回收率，非手術法移植后獲40%的妊娠率（6/15）。1975年Allen等用手術法移植1～6 d齡胚胎獲得44%妊娠率（7/16）；非手術移植子宮沖出的胚胎得到71%的妊娠率（5/7）。

馬的胚胎移植技術直到20世紀90年代才開始得到商業化的應用。在美國，由于夸特馬協會取消了每年每匹母馬只允許登記一匹幼駒的規定，因此胚胎移植技術在世界上登記數量最多的馬種協會——夸特馬協會內就得到了認可。2002年，南美與美國共有超過5 000匹運動母馬應用了胚胎移植技術。同年德國尚無1例胚胎移植應用的報道，當年全歐洲也僅有約70匹母馬使用了該技術；然而至2004年全德已有309匹運動母馬進行了胚胎移植。據國際胚胎移植協會（IETS）資料顯示，2003年全球共進行了約20 000例馬的胚胎移植處理，應用前景廣闊。

1.2 實踐價值

馬的胚胎移植技術在現代養馬業實踐中具有廣闊的應用價值。

（1）為不能妊娠足月或不能成功分娩的母馬孕育后代提供了可能。（2）可以無風險地獲得老年母馬的后代。（3）為馬屬動物胚胎的種內或種間移植提供了最佳的妊娠環境。（4）優秀競賽母馬既可參加比賽也可參與配種，不耽誤比賽時間。（5）生產冷凍胚胎，為馬的遺傳多樣性保護提供技術支持。（6）為優良馬種的引入與擴繁提供技術輔助，簡化良種引進方法。（7）提高良種母馬的繁殖力，增加每匹母馬產駒的個數。（8）促進馬的生殖生理理論與胚胎生物技術的發展。

2 操作程序

馬的胚胎移植主要包括供、受體母馬的選擇，供、受體母馬的同期發情，供體的配種，胚胎采集，胚胎質量鑒定，胚胎的移植等環節。

2.1 供、受體母馬的選擇

供體：健康，遺傳性能良好，育種價值較高，已證明對超數排卵反應較好。

受體：健康，繁殖性能良好，育種價值不高，體型不小于供體母馬。

2.2 供、受體母馬的同期發情

在胚胎移植中最耗費時間的步驟是檢查供體和受體并對它們進行同期發情處理，供體在發情同期中一旦有優勢卵泡出現就要每天檢查一次，確定排卵和配種恰當的時間。進行馬的同期發情處理時受體母馬排卵時間應在供體母馬排卵的前1～2 d至后0～3 d之間。對受體母馬在發情期9～17 d內進行前列腺素合成抑制劑處理，將受體母馬的排卵時間范圍擴大為供體母馬排卵前4～5 d至后0～3 d之間。據報道最佳排卵時間是受體母馬晚于供體母馬24 h。

孕激素、前列腺素是誘導母馬同期發情的最常用的激素，另外也有用人絨毛膜促性腺激素（HCG）、促性腺激素釋放激素（GnRH）、馬垂體提取物等作為誘導母馬同期發情的激素。

2.2.1 孕激素

供、受體母馬均可用孕激素陰道栓塞法或肌肉注射、口服孕激素法進行同期化處理。連續用孕激素處理15 d，在撤出孕激素后的3～7 d內母馬發情現象明顯，8～15 d內發生排卵。

此外，也可以連續9～10 d每天注射孕激素或口服合成孕酮，在最后一天注射前列腺素類似物。

2.2.2 前列腺素

用前列腺素處理母馬同期發情的效果不夠穩定。處理的時間和排卵的時間差異很大，報道的范圍在1～10 d之間。放牧的母馬由于不易控制發情周期，因此使用2次肌肉注射前列腺素法，間隔時間在14～18 d。用上述方法，60%的母馬在第2次肌注后的4 d內開始發情，有92%的母馬在第2次肌注后的6 d內表現發情現象。然而，同期化和排卵的時間仍然差異很大，排卵可能發生在第2次肌注后的2～12 d內。

2.2.3 人絨毛膜促性腺激素（HCG）

大部分研究是在第2次肌注前列腺素后的4～6 d內肌注HCG。在第2次肌注前列腺素后的第6天肌注HCG，在此后的72 h內有75.8%的母馬排卵。在肌注前列腺素后的第5天肌注HCG獲得了相似的排卵成功率。其他一些研究表明使用HCG同期化的效果不明顯。還有研究認為分別在第7天（第1次前列腺素使用后的第7天）和第21天（第2次前列腺素使用后的第7天）分別肌注HCG會取得不錯的同期化效果。

然而，HCG最大的缺點就是重復使用會產生抗體，但也有人認為這并不夠成影響。GnRH及其類似物逐漸取代了HCG的使用。

2.2.4 促性腺激素釋放激素（GnRH）

可以通過多次注射（12 h/次）或皮下埋植GnRH的方法完成供、受體母馬發情的同期化處理。多項報道顯示在用GnRH的商品化藥物deslorelin處理后48 h內88%～100%的母馬能夠排卵。有人認為GnRH與HCG相比，誘導大而厚的卵泡排卵成功率更高，而且GnRH不會產生抗體。

2.3 供體的配種

經過超數排卵的母馬發情后應適時配種，應使用活率高、密度大的優秀種公馬精液，而且輸精次數和每次輸精的有效精子數至少要增加1倍。

2.4 胚胎采集

胚胎在排卵后5 d 10 h到5 d 22 h進入子宮，子宮沖洗或胚胎回收可在排卵后的第6天進行，大多數學者認為在排卵后第6天收集胚胎的回收率較低，這可能與下列原因有關：（1）胚胎沒有進入到子宮；（2）技術上失敗；（3）沒有發現胚胎因為直徑小；（4）在處理過程中胚胎喪失。

通常用非手術法沖胚，在排卵后第7天收集胚胎，在沖胚前應對子宮和子宮頸的大小寬度有所估計，此外應當確定沖胚后是否立即需要用前列腺素處理，當母馬有大于35 mm的卵泡時，前列腺素處理應被推遲，一般前列腺素處理被推遲48 h，這有助于子宮從沖洗后恢復過來增加下一次輸精前正常發情周期的機率，子宮沖洗液一般選用Dulbeco's加1%的胎牛血清，有些學者認為用不用胎牛血清沒有差別。胎牛血清是防止胚胎粘附在管壁或濾器上。沖胚時將直徑1.5 cm Bivona管通入子宮，可將氣囊注入30～50 ml空氣，用2～3 L沖胚液對子宮進行沖洗，沖胚液被收集到平皿里，在實體顯微鏡下進行檢胚。先用低倍顯微鏡找到胚胎，再用高倍顯微鏡評價胚胎等級。

2.5 胚胎質量鑒定

在體視鏡下從沖卵液中回收胚胎，同時對胚胎的質量和活力進行評定或等級分類。

沖卵液溫度為35～38℃，所有培養設備也都要事先預熱達到35～38℃。

鑒定時主要觀察胚胎的形態學特點，比如形狀、色澤、卵裂球大小與均勻度、細胞密度、與透明帶間隙以及細胞變性等情況。依據這些對胚胎進行質量分級，通常分為5級，1級最佳，5級為死亡的胚胎。3級或3級以上的發育正常的胚胎才能供移植或體外培養和保存使用。

2.6 胚胎的移植

2.6.1 手術法

有人認為手術法的效果好，但手術法耗費時間長，價格昂貴，需要更多的勞動力。

首次在科羅拉多進行的手術法胚胎移入方法是將母馬用腹中線切口，在排卵同側子宮角用斷韌的針在血管少的子宮角處打孔，胚胎被裝入一個玻璃管內連同少量的移胚液移入。現在手術法多采用腹側壁肷窩處打孔。

人們建議將胚胎移入有黃體側的即排卵同側的子宮角，這樣有利于孕酮對在妊娠前15～16 d游離狀態的胚胎產生有益的影響。

2.6.2 非手術法

非手術法快捷、簡便，而且成本低。非手術法移植有兩種技術，現在應用很多。

技術A：胚胎被隔離在兩段氣栓和移植液中并被裝在一個長約5.5 cm的輸精管內，它與一個10 mL的注射器相連，將輸精管用戴有消毒手套的食指引入子宮頸口將胚胎引入子宮體內，輸精管外可套一個塑料外套。

技術B：胚胎被裝入0.5 mL毛細管內，按0.2 mL儲胚液+0.05 mL空氣+0.1 mL儲胚液+0.05 mL空氣+0.1 mL儲胚液順序裝入。

這些總體積不夠裝滿整個毛細管所以在將毛細管裝入移胚槍中后要將空氣推出，助手將母馬陰唇分開，術者用食指分開固定母馬子宮頸口后，將橡膠套管插至子宮頸的一半位置并將輸精插入子宮頸，術者將手移出陰道，伸入直腸把握排卵一側子宮角，并將輸精槍移到子宮角頂端推入。據報道技術A和技術B的受胎率相似，有工作者發現不同操作者對移植成功率的影響很大，母馬的胚胎可分為1～5級，2級和3級胚胎獲得的受胎率比1級低，母馬的畸形胚胎出現的機率不大。

3 存在問題

馬的胚胎移植雖然在美洲已得到較為廣泛的認可與應用，在歐洲也已小部分得到應用，并且在我國投入應用的時間也指日可待，但該技術的進一步推廣仍然存在一些問題。

（1）世界上仍有許多馬種協會對于用胚胎移植生產的幼駒不予登記，這一制度的限制是胚胎移植技術進一步推廣的最大障礙。

（2）許多私人育馬者從個人感情上對于胚胎移植技術的使用仍持有異議，大多數只是將育馬當作一種愛好，并不關心母馬繁殖力的提高問題。

（3）供體母馬超排效果不理想。由于馬是單胎動物，經超排處理后排卵數平均僅為3個左右，也尚未找到非常理想的超排藥物。

（4）非手術法移植的妊娠率低。

（5）胚胎移植所產幼駒成年后運動性能可能受到一定的影響。

（6）胚胎移植費用高，人力和時間消費大，條件嚴格。

4 發展趨勢

馬的胚胎移植技術已基本成熟，近十年來取得了一定范圍的應用。近年來我國現代馬業的快速發展，新技術研究將在馬業中得到體現，運動馬匹繁殖改良數量日益增加，并且在品種登記中并未限制生物技術的應用，因此馬的胚胎移植將在我國具有潛在的發展前景。

隨著越來越多的馬種登記協會對胚胎移植技術的認可，將來在世界范圍內會不斷增強該技術推廣應用的力度，從而也反過來推動科研技術的進展。