霍煒潔，李 琳，劉 彧，劉洪林，盛春花

(1.中國水利水電科學(xué)研究院標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100038；2.山東省水文中心，山東 濟南 250002)

“驗證(Verification)”來源于拉丁語，演化自動詞verificare(verify)，意為確定某物的真實性、準(zhǔn)確性和有效性的過程[1]。ISO 17025：2017《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求》[2]對“驗證”進行了定義，指提供客觀證據(jù)證明給定項目滿足規(guī)定要求。項目可以是一個過程、測量程序、物質(zhì)、化合物或測量系統(tǒng)等。標(biāo)準(zhǔn)方法驗證是證實標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的要求已被實現(xiàn)的過程。從狹義上講，是標(biāo)準(zhǔn)制定過程中對相關(guān)方法的技術(shù)指標(biāo)進行確證的過程，為標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)合理和先進適用提供數(shù)據(jù)支撐；從廣義上來講，標(biāo)準(zhǔn)驗證覆蓋標(biāo)準(zhǔn)制修訂和實施過程，即在標(biāo)準(zhǔn)的主要生命周期中驗證其適用性、合理性和可操作性[3- 4]。

當(dāng)前水化學(xué)分析技術(shù)發(fā)展日新月異，檢測方法快速迭代更新，新方法新標(biāo)準(zhǔn)層出不窮。實驗室采用新的標(biāo)準(zhǔn)方法前，首先要進行技術(shù)驗證，驗證是否能夠按照方法要求開展實驗，獲得滿意的實驗結(jié)果。實驗室管理相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，如ISO 17025：2017[2]、RB/T 214—2017《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定能力評價檢驗檢測機構(gòu)通用要求》[5]、CNAS-CL 01：2018《檢驗和校準(zhǔn)實驗室能力認可準(zhǔn)則》[6]均對首次使用標(biāo)準(zhǔn)方法要求開展方法驗證進行了規(guī)定，提出實驗室引入標(biāo)準(zhǔn)方法前，需要驗證是否能正確使用該方法，以此確保實驗過程中方法的正確性。

方法驗證是實驗室獲得某項檢測能力的第一個環(huán)節(jié)，而且是系統(tǒng)性的能力確認，不僅需要識別相應(yīng)的人員、設(shè)施環(huán)境、儀器設(shè)備等資源是否滿足要求，而且還需要對標(biāo)準(zhǔn)方法的準(zhǔn)確性和可靠性等技術(shù)指標(biāo)進行驗證，如檢出限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、正確度、精密度等。必要時還需要進行實驗室間比對和能力驗證，以證明具備該標(biāo)準(zhǔn)方法所需檢測能力。如何做好方法驗證，是考量實驗室技術(shù)能力的關(guān)鍵。

1 分析系統(tǒng)驗證

實施一項水質(zhì)分析檢測，從樣品采集到出具檢測數(shù)據(jù)是一項系統(tǒng)性工作，GB/T 32465—2015《化學(xué)分析方法驗證確認和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》[7]將影響檢測結(jié)果質(zhì)量的條件范圍，包括儀器、試劑、操作程序、檢測樣品、工作人員、環(huán)境和質(zhì)量保證措施等定義為分析系統(tǒng)。方法驗證整體對應(yīng)分析系統(tǒng)進行驗證。

按照RB/T 214—2017[5]，實驗室應(yīng)對照標(biāo)準(zhǔn)方法的要求準(zhǔn)備相應(yīng)的儀器、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、軟件、試劑、參考物質(zhì)、輔助設(shè)備如前處理裝置等。對檢測結(jié)果有影響或計量溯源性有要求的儀器，按照檢定規(guī)程、校準(zhǔn)規(guī)范或檢測方法完成檢定、校準(zhǔn)或核查，并對計量溯源結(jié)果是否滿足檢測要求進行確認。核查方法要求的環(huán)境條件，包括樣品采集、保存和運輸環(huán)境要求以及檢測過程環(huán)境要求，是否需配備通風(fēng)、防震、降噪，無菌、控溫、控濕設(shè)備設(shè)施等。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法確定實施方法驗證人員的能力要求，其中包括采樣人員、檢測人員、儀器設(shè)備操作人員等，根據(jù)要求選擇人員，組織人員進行新方法的宣貫和培訓(xùn)，培訓(xùn)后還需要對人員技術(shù)情況進行監(jiān)督和記錄。因方法驗證是新技術(shù)、新方法的探索，在各項資源配備中，人員能力是實施方法驗證的關(guān)鍵。驗證人員應(yīng)明確方法驗證的目的、意義和標(biāo)準(zhǔn)方法實施過程中的風(fēng)險點；掌握標(biāo)準(zhǔn)方法內(nèi)容，熟悉所用試劑、器皿的要求并完成準(zhǔn)備，掌握前處理步驟及注意事項、儀器調(diào)試及參數(shù)設(shè)定、上機操作步驟、數(shù)據(jù)計算、計算結(jié)果保留位數(shù)、記錄表格設(shè)計等，還應(yīng)掌握質(zhì)量控制如空白試驗、平行試驗、結(jié)果分析與統(tǒng)計等要求。

分析系統(tǒng)的驗證是確認實驗室是否具備開展標(biāo)準(zhǔn)方法檢測所需要的資源的驗證，是確保獲得正確的檢測數(shù)據(jù)的前提。

2 方法性能指標(biāo)驗證

分析系統(tǒng)的驗證確認滿足要求后，可以開始對標(biāo)準(zhǔn)方法的技術(shù)指標(biāo)進行驗證。定量水質(zhì)分析標(biāo)準(zhǔn)方法的典型技術(shù)指標(biāo)包括檢出限、定量限、靈敏度、選擇性、線性范圍、測量區(qū)間、精密度(重復(fù)性和再現(xiàn)性)、正確度等[7- 8]。本文選擇關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)方法檢出限、校準(zhǔn)曲線、正確度和精密度的驗證要點進行探討。

2.1 方法檢出限驗證

檢出限指樣品中可被(定性)檢測，但并不需要準(zhǔn)確定量的最低含量(或濃度)，是在一定置信水平下，從統(tǒng)計學(xué)上與空白樣品區(qū)分的最低濃度水平(或含量)。檢出限包括儀器檢出限和方法檢出限，方法檢出限指用特定方法可靠地將分析物測試信號從特定基質(zhì)背景中識別或區(qū)分出來時分析物的最低濃度或量，確定檢出限時，應(yīng)考慮到所有基質(zhì)的干擾[8]。

隨著檢測技術(shù)高速發(fā)展，環(huán)境水體中痕量污染物不斷被檢出，痕量污染物的檢出濃度普遍位于方法檢出限附近。因此方法檢出限在環(huán)境監(jiān)測中尤為重要，方法驗證得出的檢出限水平也反映出實驗室的檢測能力。

關(guān)于檢出限的文獻報道和討論很多，涉及檢出限的定義、分類、計算以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計等[9- 12]。如何正確或準(zhǔn)確地估算檢出限在國際分析領(lǐng)域一直存有爭議。檢出限的意義在于考察一個分析方法在低濃度范圍的檢測性能，基于不同角度而有不同側(cè)重點。對于水質(zhì)分析標(biāo)準(zhǔn)方法驗證，通常傾向于更靈活以及更具有可操作性的計算方法。

方法檢出限的計算方法主要包括空白平行測定標(biāo)準(zhǔn)差的倍數(shù)、逐步稀釋法、最小檢測能力計算等。測定方法、測定儀器設(shè)備、空白樣品目標(biāo)組分檢出情況不同，方法檢出限的計算方法和表達方式也不同。

利用空白平行測定標(biāo)準(zhǔn)差的倍數(shù)方法計算檢出限是最常采用的方法。HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》[13]中方法檢出限一般確定方法的計算演化自美國EPA方法。當(dāng)空白試驗中檢測出目標(biāo)物，重復(fù)7次以上，即n大于等于7次空白試驗，可按下式進行計算：

MDL=t(n-1，099)×S

(1)

式中，MDL—方法檢出限；n—樣品的平行測定次數(shù)；t—自由度為n-1，置信度為99%時的t分布值(單側(cè))；S—n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

使用該方法的前提是空白試驗中能檢出目標(biāo)組分，且任意測定值之間可允許的差異范圍為“空白試驗測定值的均值±估計檢出限的1/2”以內(nèi)。若空白試驗值超出了允許的差異范圍，應(yīng)對所用試劑的純度以及儀器的靈敏度和穩(wěn)定性進行核查。若空白試驗中未能檢出目標(biāo)組分，則需要預(yù)估檢出限，向空白樣品中加入估計方法檢出限3～5倍的目標(biāo)組分，重新測定，按上式計算檢出限，判斷檢出限的合理性。如果目標(biāo)組分濃度不在計算出的方法檢出限3～5倍范圍內(nèi)，則需調(diào)整樣品濃度，重新測定。

SL 219—2013《水環(huán)境監(jiān)測規(guī)范》[14]對檢出限的規(guī)定參考了《全球環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)水監(jiān)測操作指南》。其規(guī)定給定置信水平為95%時，樣品測定值與零濃度樣品的測定值有顯著性差異即為檢出限。每次對空白試驗進行平行測定，當(dāng)空白測定次數(shù)少于20次時，計算公式如下：

(2)

式中，MDL—方法檢出限；tf—顯著水平為0.05(單側(cè))，自由度為f時的t值；Swb—空白平行測定(批內(nèi))標(biāo)準(zhǔn)偏差。當(dāng)空白測定次數(shù)大于20次時，按如下公式計算：

MDL=46×Swb

(3)

該方法的前提也是需要空白樣品的測定值不能為零，若儀器分辨力低，空白樣品測定值為零則可配置接近于零濃度的實驗用水進行測定和計算。

值得注意的是，該方法中計算的空白標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)為批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差，祝旭初[9]以《土壤和沉積物鈹?shù)臏y定石墨爐院子吸收光度分析法(征求意見稿)編制說明》方法驗證報告為例，進行了檢出限計算方式的探討。方法驗證報告中采用空白批間標(biāo)準(zhǔn)偏差計算檢出限，批間影響高度顯著，建議應(yīng)在盡量相同的試驗條件下，在盡可能集中的時間間隔內(nèi)完成測定，由于計算批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差確定檢出限的方法納入了時間和試驗環(huán)境條件的影響，因此采用空白批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差計算檢出限更具有統(tǒng)計意義。而且樣品分析、標(biāo)準(zhǔn)曲線制定和空白測定亦應(yīng)同步進行。

除了較常采用的空白標(biāo)準(zhǔn)偏差倍數(shù)法，GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認和驗證指南》[8]還列舉了目視評價法、校準(zhǔn)方程參數(shù)評估法、信噪比法。目視評價法通過繪制陽性(或陰性)結(jié)果百分比與濃度相對應(yīng)的反應(yīng)曲線確定閾值濃度，類似于逐步稀釋法。校準(zhǔn)方程參數(shù)評估方法和信噪比法主要用來評估儀器的檢出限。HJ 168—2020還對分光光度法、滴定法、離子選擇電極法、微生物計數(shù)法等方法的檢出限計算進行了規(guī)定。

對于判定方法檢出限驗證的結(jié)果是否滿足要求，GB/T 32465—2015[7]進行了規(guī)定，若標(biāo)準(zhǔn)方法給出方法檢出限，則在給出的方法檢出限濃度水平上，通過分析該濃度水平的樣品來驗證方法檢出限，分析結(jié)果應(yīng)在給出的方法檢出限的±20%范圍內(nèi)，若未給出方法檢出限，實驗室應(yīng)選用合適的方法研究或計算表示。在實驗室實際方法驗證過程中，通常是根據(jù)分析技術(shù)方法的特點選擇檢出限計算方法，然后與標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限進行比較，這種情況下需選擇合適的計算方法，還應(yīng)注意所選方法的適用條件。

2.2 校準(zhǔn)曲線驗證

校準(zhǔn)曲線通常以測得的待測物濃度或含量為橫坐標(biāo)，以各濃度點對應(yīng)的如吸光度、峰高、積分峰面積等儀器響應(yīng)信號值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用線性回歸方程計算校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)、截距和斜率。校準(zhǔn)曲線的斜率體現(xiàn)了方法的靈敏度，環(huán)境條件、試劑、儀器運行條件等因素的變化會在一定程度上影響校準(zhǔn)曲線。

通常按照標(biāo)準(zhǔn)方法校準(zhǔn)曲線設(shè)定的濃度點進行驗證，標(biāo)準(zhǔn)方法中有明確要求的，驗證應(yīng)以滿足標(biāo)準(zhǔn)方法要求為主，如HJ 503—2009《水質(zhì)揮發(fā)酚的測定4-氨基安替比林分光光度法》[15]就對校準(zhǔn)曲線回歸方程相關(guān)系數(shù)要求達到0.999以上。標(biāo)準(zhǔn)方法中沒有對相關(guān)系數(shù)進行要求，可參考GB/T 32465—2015[7]的規(guī)定，在方法規(guī)定的工作范圍內(nèi)確定校準(zhǔn)曲線的各個濃度點，濃度點個數(shù)應(yīng)在校準(zhǔn)曲線濃度范圍均勻布置6個或以上的校準(zhǔn)點，不同濃度的校準(zhǔn)點應(yīng)該單獨配置，不能通過稀釋同一個母液獲得，相關(guān)系數(shù)r不小于0.997。校準(zhǔn)曲線應(yīng)與樣品同時測定，且要定期確定校準(zhǔn)曲線是否穩(wěn)定，即在不同時間，制作同一條曲線的重復(fù)性。

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也進行了規(guī)定，SL 219—2013[14]中規(guī)定相關(guān)系數(shù)絕對值宜大于0.999，使用校準(zhǔn)曲線時，測試樣品濃度宜控制在曲線的20%～80%范圍內(nèi)。HJ 168—2020從制定標(biāo)準(zhǔn)方法的角度，要求包括零濃度在內(nèi)6個校準(zhǔn)點，定量方法線性回歸方程相關(guān)系數(shù)不低于0.999。

校準(zhǔn)曲線的確認除了相關(guān)系數(shù)外，必要時還需要進行斜率和截距的檢驗，如果標(biāo)準(zhǔn)方法要求校準(zhǔn)曲線通過零點，還應(yīng)進行是否通過零點的檢驗。

2.3 正確度驗證

正確度指無窮多次重復(fù)測量所得量值的平均值與一個參考量值間的一致程度[16]。在描述測量準(zhǔn)確程度時，也會使用到準(zhǔn)確度的概念，準(zhǔn)確度指被測量的測得值與其真值間的一致程度。當(dāng)測量提供較小的測量誤差時就說該測量是較準(zhǔn)確的。“測量準(zhǔn)確度”不宜用于表示“測量正確度”。測量準(zhǔn)確度當(dāng)用于一組測試結(jié)果時，由隨機誤差分量和系統(tǒng)誤差分量組成[17]，因此測量準(zhǔn)確度與正確度和精密度有關(guān)，測量正確度和精密度用來衡量測量的準(zhǔn)確度。

正確度的高低體現(xiàn)了試驗過程中系統(tǒng)誤差的大小。實驗室驗證正確度，通常采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品核查，以及回收率測定的方式，也可采用參加能力驗證、與經(jīng)典方法或公認方法進行比對的方式。

采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者有證標(biāo)準(zhǔn)樣品驗證測量的正確度，通過重復(fù)性檢測，分析重復(fù)測定值的平均值與接受參考值的偏差，偏差不得超過±10%，或者使用統(tǒng)計分析方法，比較檢測結(jié)果平均值與參考值是否有顯著差異，確認這種差異是否可以被接受[7]。較常用的方法是測定有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品，結(jié)果偏差小于不確定度即說明測定結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的[18]。

采用加標(biāo)回收率方法驗證正確度，最理想的是使用與樣品的基質(zhì)匹配且濃度相近的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品進行實驗。若沒有有證標(biāo)準(zhǔn)樣品，可選擇替代物來進行回收率實驗。不同加標(biāo)濃度，回收率可能不同，通常加標(biāo)濃度越低，回收率越低，設(shè)定加標(biāo)濃度宜覆蓋整個測試范圍的目標(biāo)組分濃度。GB/T 27417—2017[8]標(biāo)準(zhǔn)給出了不同濃度水平范圍對應(yīng)的回收率范圍，并強調(diào)了回收率試驗樣品應(yīng)與實際樣品的基質(zhì)匹配，因此加標(biāo)回收試驗不是簡單的空白樣品加標(biāo)回收試驗，而是實際樣品的加標(biāo)回收試驗。HJ168—2020[13]也對正確度驗證進行了明確的規(guī)定，但該標(biāo)準(zhǔn)中未給出回收率評價范圍。SL 219—2013[14]附錄A中列出了地表水、地下水、大氣降水、污廢水等不同常見檢測項目，在推薦監(jiān)測分析方法下，不同樣品含量范圍對應(yīng)的準(zhǔn)確度允許差，可供評價參考。

2.4 精密度驗證

精密度指在規(guī)定條件下，獨立測試結(jié)果間的一致程度[17]。精密度大小體現(xiàn)了試驗過程中隨機誤差的大小。隨機誤差不可避免，而產(chǎn)生隨機誤差的因素也不能完全控制，諸如檢測人員、儀器設(shè)備、環(huán)境條件、測量時間間隔等。精密度通常用標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。

重復(fù)性和再現(xiàn)性檢測條件下的精密度是不同的。重復(fù)性體現(xiàn)了測定結(jié)果的短期變化。方法重復(fù)性可以通過準(zhǔn)備不同濃度的樣品或濃度與做回收率相近的樣品，在較短的時間間隔內(nèi)由同一個分析員進行分析測定，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差。必要時需要驗證再現(xiàn)性條件下的精密度，確認再現(xiàn)性時，應(yīng)盡可能涵蓋時間、人員、試劑、環(huán)境條件及其他不可控的微小因素的影響。標(biāo)準(zhǔn)GB/T 32465—2015[7]也給出了不同濃度或含量的樣品期望精密度，可用以評價實驗室測定的精密度。

精密度與正確度相同，不同的樣品基質(zhì)以及不同的分析物濃度，精密度可能會存在差異。因此精密度評估需要選擇每個類型代表性的樣品進行測定，而且一個方法的精密度通常會隨著分析物濃度降低而變差，也應(yīng)該考慮在不同濃度點進行精密度的驗證。

HJ 168—2020規(guī)定通過有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和實際樣品測定，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。也可采用實際樣品基體加標(biāo)進行驗證。

水利行業(yè)是通過精密度偏性試驗確定實驗室測試結(jié)果的精密度。SL 219—2013[14]規(guī)定對空白溶液(試驗用純水)、0.1C標(biāo)準(zhǔn)溶液(C為檢測上限濃度)、0.9C標(biāo)準(zhǔn)溶液、實際水樣、0.5C實際加標(biāo)水樣(臨用前配制)5類樣品，每日1次平行測定，共測6次。比較各組溶液的批內(nèi)變異與批間變異，檢驗變異的差異性。比較實際水樣與標(biāo)準(zhǔn)溶液測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差，判斷實際水樣中是否存在影響測定精密度的干擾因素。附錄A中列出了地表水、地下水、大氣降水、污廢水等不同常見檢測項目，在推薦監(jiān)測分析方法下，不同樣品含量范圍對應(yīng)的精密度允許差，可供評價參考。

通常計算標(biāo)準(zhǔn)偏差要有足夠多的測量次數(shù)，計算時按統(tǒng)計方法要求剔除異常值，再進行標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算。

3 結(jié)語

水質(zhì)分析標(biāo)準(zhǔn)方法有其共性特征，也有檢測不同目標(biāo)組分對應(yīng)的特殊要求，而且不同時期發(fā)布的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)方法，其內(nèi)容設(shè)置、技術(shù)指標(biāo)以及質(zhì)量控制措施也不盡相同。由于標(biāo)準(zhǔn)方法驗證是證實標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的要求已被實現(xiàn)的過程，因此，水質(zhì)分析標(biāo)準(zhǔn)方法驗證技術(shù)指標(biāo)還應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容為主，參考普適性的國家標(biāo)準(zhǔn)要求和行業(yè)特殊要求。標(biāo)準(zhǔn)在實施過程中也會不斷更新、完善，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)方法修訂后重新發(fā)布，新標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用到新的基質(zhì)，樣品前處理過程、檢測的儀器設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵步驟等要素發(fā)生變化，均應(yīng)該針對變化內(nèi)容進行再驗證。

標(biāo)準(zhǔn)方法驗證具有系統(tǒng)性、持續(xù)性特點，涉及檢測過程中人、機、料、法、環(huán)、測各個環(huán)節(jié)，本文從儀器設(shè)備、環(huán)境條件和人員能力等資源性驗證要求到標(biāo)準(zhǔn)方法典型技術(shù)指標(biāo)的驗證要點進行了探討，以期推動水質(zhì)分析標(biāo)準(zhǔn)方法驗證工作有效開展。