MicroRNA 于彌漫大B 細胞淋巴瘤診療中的作用

張翰鈺 李敬東

1.河南省新鄉醫學院第一臨床學院，河南新鄉 453100；2.河南省新鄉醫學院第一附屬醫院血液科，河南新鄉 453100

彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常見的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），占全球成人NHL 的近30%[1]。該疾病發病年齡為60～70 歲，男性高于女性。DLBCL是一種在臨床表現、組織形態、治療反應及預后等方面有很大異質性的侵襲性腫瘤[2]。目前診斷淋巴瘤的主要依據是病理組織活檢，基于組織病理學、基因表達和圖像評估指導臨床治療，對于DLBCL 治療反應監測，臨床上常用的方法主要為觀察患者淋巴結或淋巴器官腫塊消退的情況、影像學表現及臨床癥狀的改善，到目前為止仍無有效、精確、動態的評估方法。所以床上亟待一種新的、無創、高效、更易獲得的技術手段用于其診斷和預后評估。隨著高通量測序平臺的出現及生物信息學的發展，已經鑒定出約有2 100 種不同的MicroRNA（miRNA），其中約有300 種在各種細胞類型中表達。研究顯示，miRNA 表達譜可以區分淋巴瘤組織和正常淋巴結，并且在不同亞型中表達程度不同[3]。探索miRNA 在淋巴損傷中的作用將有助于發現新的預后和反應監測生物標志物，越來越多的miRNA被用于惡性腫瘤檢測指標的候選者[4]。隨著對miRNA的深入研究，其在DLBCL 中的作用逐漸被揭露本文就循環中miRNA 在DLBCL 診療中應用的研究進展進行描述。

1 miRNA 與DLBCL 的腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）

1983 年，Pan 和Johnstone 在研究綿羊網織紅細胞成熟過程中，發現轉鐵蛋白受體釋放到細胞外空間與一種小囊泡有關，首次發現了外泌體[5]的存在。研究結果提示在正常的生理過程和疾病的發生機制中，外泌體均在細胞間通訊中發揮了重要的作用[6]。其中外泌體中蛋白、RNA 和脂肪成分特異，且攜帶了一些重要的信號分子，有望在疾病早期診斷中發揮作用，大量文獻報道，miRNA 是外泌體最為核心的效應分子[7]。

miRNA 是一類內生的、分布廣泛、長度為20～24 個核苷酸組成的非編碼RNA（non-coding RNA），是由具有發夾結構的70～90 個堿基大小的單鏈RNA 前體經過Dicer 酶加工后生成，不同于siRNA 但是和siRNA密切相關，可以與目的信使RNA 的3’-UTR 結合沉默基因的轉錄進而影響它的表達。miRNA 參與調節多中生物信號傳導通路，可調節數百個靶基因[8]。已有研究證實miRNA 參與多種重要的生物程序如細胞增殖、細胞分化、細胞遷移、疾病的發生與發展，調控造血系統及導致血液惡性腫瘤的發生[9]。

B 細胞淋巴瘤是由成熟B 細胞轉化而來，主要發生在淋巴結或淋巴系統的其他部位，可以發生在正常B 細胞分化的不同階段。Arthur 等[10]指出在淋巴瘤中發現基因改變通常與B 細胞發育和/或分化的途徑相關，所以B 細胞分化過程似乎容易發生惡性轉化。除了基因的改變外，表觀遺傳調節因子，尤其是miRNA，在B 細胞發育過程中起到了關鍵作用，同時也參與了B 淋巴細胞的形成。

miRNA 在B 細胞惡性腫瘤中表達的相關性首次在慢性淋巴細胞白血病中（chronic lymphocytic leukemia，CLL）發現，為miRNA 在癌癥發病機制中的突出和復雜作用提供了一個模型，特別是在B 細胞淋巴瘤發病機制中。DLBCL 主要內在致癌途徑與異常的c-MYC和NF-κB 活性有關，研究證實DLBCL 患者中存在多種miRNA 的異常表達，miRNA 的失調間接抑制某些基因的表達從而導致疾病的發生，其中最常見的是miR-155。近年來，科研工作者對其參與疾病的發生、發展、治療及預后展開了如火如荼的研究。Zhu 等[11]發現與臨近組織比較，淋巴瘤組織中miR-155 表達水平更高，miR-155 下調抑制細胞周期相關蛋白（細胞周期相關蛋白B1、細胞周期相關蛋白D1、CDK4）的表達，但增加了凋亡相關蛋白水平（Bax/Bcl-2 和cas pase3 活性）和抑制炎癥因子的分泌。此外，還觀察到miR-155 水平與轉化生長因子-β 受體2（transforming growth factor-β receptor 2，TGF-βR2）水平呈負相關，TGF-βR2 已被證明是一種新型腫瘤抑制基因[12]。Janus 激酶（JAK）-信號轉導和轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路參與細胞分化、增殖和凋亡，并與淋巴瘤有關。細胞信號轉導抑制因子3（suppressors-of-cytokine-signaling 3，SOCS3）是JAK-STAT 信號通路的調節因子，生物信息學分析顯示，miR155 和SOCS3 存在互補位點。研究顯示miR-155-5p 通過SOCS3/JAK-STAT3 信號[13]和靶向SMAD5 促進細胞增殖和阻斷凋亡，從而逃避TGF-β1 的生長抑制作用[14]。Li 等[13]通過對DLBCL 及反應性淋巴結增生患者的研究發現DLBCL 組織中miR-155 表達顯著增加，而SOCS3 水平下降，并在體外實驗中進一步證明miR-155 可以靶向調節SOCS3的表達從而調控JAK-STAT 信號通路從而調控DLBCL 疾病的發生發展。Zheng 等[15]發現miR-155 可作為B 細胞淋巴瘤的致癌標志物，與疾病發生呈正相關，并且與T 細胞受體傳導、細胞周期及p53 信號傳導途徑密切相關。并進行體內外檢查發現B 淋巴瘤細胞來源的miR-155 特異性調節Fas 介導的CD8+T 細胞的凋亡，同時發現腫瘤細胞和CD8+T 細胞之間通過miR-155-PD-L1 調節軸的功能相互作用，導致B 淋巴瘤對抗PD-L1 抗體敏感，提示miR-155 是B 細胞淋巴瘤的抗PD-L1 抗體治療的潛在靶點。

隨著對miRNA 研究的深入及生物信息學的快速發展，越來越多的miRNA 在TME 被發現。Xu 等[16]通過挖掘RNA-seq 數據和生物信息學分析，并行體內外實驗發現miR-340-5p 與DLBCL 患者CD8+腫瘤浸潤性T 細胞（tumor-infiltrating T cells，T-TILs）呈正相關，KMT5A 是miR-340-5p 的直接靶基因，同時也證實了miR-340-5p 通過調節KMT5A 和COP1 并進一步激活CD73 泛素化來促進CD8+T-TIL 浸潤和抗腫瘤功能。同樣的，李敬東等[17]通過對SU-DHL-4 細胞進行研究證實了miR-34b-5p 過表達導致E-cadherin 基因和蛋白的表達水平升高，而N-cadherin 和Vimentin基因的蛋白表達水平降低，以至抑制SU-DHL-4 細胞增殖、侵襲并誘導細胞凋亡，同時miR-34b-5p 過表達抑制RhoA/ROCK 信號通路。證實了TME 中的CD8+T-TILs 在腫瘤發展中的重要作用。

miR-21 在多種腫瘤中的表達顯著升高及其在TME 中顯示出調節潛力，其主要作為一種腫瘤抑制因子，對腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和腫瘤生長起調節作用[18]。相關研究顯示，ABT-199 是一種特異性Bcl-2抑制劑，靶向Bcl-2 的BH3 結合域，并在治療B 細胞淋巴瘤方面顯示出令人鼓舞的臨床前結果[19]。Zheng等[20]在探索miR-21 在TME 中作用時證實了miR-21作為DLBCL 的血清致癌生物標志物，而且發現mi-R21 通過ICOS/ICOSL 軸增加了Treg 細胞與內皮細胞的相互作用并刺激了腫瘤血管生成。

2 miRNA 與DLBCL 治療新靶點的探索

2.1 miR-155 在DLBCL 診療中的應用

對于DLBCL 的治療，R-CHOP 方案已成為新診斷DLBCL 患者的標準治療方案，但仍有一部分患有難治性或復發性疾病的治療效果欠佳，促使科研工作者們努力探索治療DLBCL 的新靶點[21]。Cobomarsen 是一種單鏈、化學修飾的miR-155 靶向寡核苷酸，是一種基于LNA（一種類寡核苷酸衍生物）的抗miR-155化合物，基于這些結果，對于cobomarsen 的治療作用開展多種臨床試驗[22]。Anastasiadou 等[23]研究了cobomarsen 在具有高miR-155 表達的ABC-DLBCL 細胞系和異種移植小鼠模型中的功效和藥效學活性，并且評估其在侵襲性DLBCL 患者中的治療效果和安全性的研究中發現cobomarsen 可以與其靶標結合并抑制其作用于miR-155 生物傳感器的互補序列，可以被遞送并在細胞內具有活性，并且可以抑制miR-155導致DLBCL 細胞增殖減少和凋亡增加。在異種移植小鼠模型中還觀察到了靜脈注射cobomarsen 可減少腫瘤體積、觸發細胞凋亡并抑制miR-155 靶基因表達。同時在診斷為侵襲性ABC-DLBCL 患者治療中觀察到其安全性，不足的是該研究只在1 例患者身上評估了安全性。Huang 等[24]也在探索胃DLBCL 的治療新方法時發現，miR-155-DEPTOR 通路的激活是對幽門螺桿菌治療耐藥的標志物。雖然上述研究各有局限性，對但仍為DLBCL 的治療提供了新的思路。

2.2 miR-28 在DLBCL 診療中的應用

許多miRNA 位于癌癥相關基因組區域并且失調的miRNA 作為致癌基因對多種惡性腫瘤發病機制中發揮作用，這些特征為DLBCL 的治療新的靶點的研究提供思路。miR-28 是一種在B 細胞轉化過程中經常丟失的生發中心（germinal center，GC）特異性miRNA，研究發現miR-28 通過損害記憶B 細胞和漿細胞分化來調節原代B 細胞中的GC 反應。定量蛋白質組學結合轉錄組分析確定了參與細胞周期和B 細胞受體信號傳導的miR-28 靶標，發現miR-28 表達減少了體外原代細胞和淋巴瘤細胞的增殖尤其是在DLBCL異種移植物中的重新表達阻止了腫瘤生長[25]。近年來，miRNA 在癌癥發展過程中發揮重要作用使其成為非常有前景的治療靶點選擇[26]。使用合成模擬物阻斷DLBCL 生長被認為是治療性miRNA 引入的最安全的途徑，相關實驗從治療角度和毒性分析上驗證了miR-28 的毒性遠遠低于目前治療B 細胞淋巴瘤的治療策略，因此miR-28 替代可作為DLBCL 治療的新策略[25]。

2.3 miR-198 在DLBCL 診療中的應用

硼替佐米（Bortezomib，BTZ）是一種蛋白酶體抑制劑，已在美國和歐洲國家被批準用于多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的治療，隨著對BTZ 研究的深入，越來越多的證據揭示了BTZ 可以抑制活化的B細胞型淋巴瘤的進展。為探索BTZ 在調節DLBCL 細胞生長的潛在分子機制，Wang 等[27]監測到BZT 影響DLBCL 細胞系CRL-2630 的生長并且上調了該細胞系中miR-198 的表達。同時使用信息生物學工具預測miR-198 結合高遷移率組AT-hook1（high mobility group AT-hook1，HMGA1）的3’-非翻譯區并抑制DLBCL 細胞中HMGA1 的表達。與BZT 誘導的miR-198 過表達一致，BTZ 抑制了DLBCL 細胞中HMAG1的豐度，HMGA1 的過表達減弱了BTZ 誘導的DLBCL細胞系的凋亡，為DLBCL 的治療提供新的研究思路。但目前關于miR-198 在DLBCL 中的更多作用未被發現，仍需要進一步探索。

3 miRNA 與DLBCL 預后評估中的作用

盡管標準R-CHOP 化療可明顯改善DLBCL 的臨床結果，但對于復發或難治性患者的預后較差[28]。分子異質性導致DLBCL 的多種結果，準確預測疾病復發和存活率對于實施風險適應治療策略至關重要[29-30]，因此，使用易得的循環預后生物標志物識別高危患者在DLBCL 中非常重要。Sun 等[31]使用miRNA PCR 陣列分析了20 例DLBCL 患者在診斷、緩解和復發時血清樣本中的miRNA 表達譜，建立了基于四種循環miRNA（miR-21、miR-130b、miR-155 和miR-28）的預后模型，并在279 例患者的訓練隊列和225 例患者的驗證隊列中進行了測試，通過單變量和多變量分析評估顯示4 種循環miRNA 預后模型有效地預測了DLBCL的復發和存活，此外TME 有助于其在DLBCL 進展中的作用。同樣的，對于不同亞型DLBCL 患者預后的探索發現miR-208a-5p 和miR-296-5p 顯示與患者更好的生存相關，而miR-1304-5p 過表達提示生存預后較差，與DLBCL 亞型無關[32]。

最近，在一項DLBCL 患者血清中miRNA 譜的初步研究中發現循環miR-22 與DLBCL 的治療反應有關，是作為其他獨立于公認預后因素（IPI、來源細胞、MYC/BCL2 易位）的預測性生物標志物[33]。在一項探討血漿中miR-155 對DLBCL 患者預后的評估的研究中發現，miR-155 的相對表達水平與B 癥狀、LDH 水平、疾病晚期、IPI 評分密切相關，更重要的是miR-155水平升高的患者的總生存期（overall survival，OS）較短[34]。綜上，多種miRNA 聯合用于DLBCL 預后的評估將是一種更有效的診斷工具。

4 小結與展望

隨著生物信息學和高通量測序平臺的發展，對miRNA 在DLBCL 疾病的發生機制、良惡性診斷及鑒別、臨床治療新方法的選擇及預后中的作用有了更深的認識，將會有更多的研究成果有望指導臨床工作，提高患者的生存質量。但多種miRNA 在多種腫瘤細胞中均有表達，缺少特異性，miRNA 在DLBCL 患者中聯合應用或許對疾病診治中的作用更準確。同時開發和廣泛驗證能夠準確提取和重復測量與DLBCL 相關的miRNA 的新方法，將循環標志物、臨床參數結合起來，疾病的診治將會更受益于患者。但是目前對于miRNA 的研究尚未應用于臨床，進一步的探索及開發經濟的miRNA 試劑盒將有助于基礎研究與臨床研究相結合。