鈣衛蛋白S100A8/A9在膿毒癥發生發展中的作用機制

田 圓，梁 群，潘郭海容，吳麗麗

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

S100蛋白家族是一類低分子量(9～14 kDa)的鈣結合胞質蛋白，1965年作為神經蛋白首次提取于牛的大腦，因其在100%飽和硫酸銨中的溶解性而得名S100[1]。目前已發現該蛋白家族至少有27個序列和結構高度相似的成員。大多數S100蛋白通常以二聚體形式存在，這些蛋白既可以由兩個相同的蛋白[(S100A1)2、(S100B)2、(S100A11)2]組成同源二聚體，也可以由兩個不同成員(S100A1/S100B、S100A8/S100A9)組成異源二聚體。

最典型的異源二聚體S100A8/A9(calprotectin, MRP8/MRP14)，因表面疏水基導致的核間非共價作用，以及較相應的同源二聚體相對較大的埋藏表面積(<10%)，使其較同源二聚體更易形成(約占二聚體總數的64.5%)[2]。鈣衛蛋白(calprotectin，CP)最早被發現于中性粒細胞中，表達具有組織和細胞特異性，主要表達在髓樣細胞(myeloid cells)內，在中性粒細胞內表達最多，占中性粒細胞胞漿可溶性成分的40%～50%[3]，在單核細胞中約占5%，活化的上皮細胞[4]、內皮細胞及角質形成細胞[5]中也有表達。其核心功能結構域EF-hand可結合Ca2+，使蛋白的構象發生改變，暴露出與靶蛋白相互作用的位點，從而參與細胞骨架重排和花生四烯酸代謝等，發揮相應的生物學功能[6]。在炎癥過程中，CP被主動釋放，通過觸發Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)4或晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end produ-cts，RAGE)介導的多種炎癥途徑，調節G-CSF的產生和誘導白細胞介素(IL)-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎細胞因子的表達，是炎癥啟動和維持的關鍵介質。

膿毒癥是由感染引發的機體反應失控導致的危及生命的器官功能障礙[7]。據我國2020年一項針對全國44所醫院重癥監護病房(ICU)的研究報告[8]顯示，ICU患者膿毒癥的發病率為20.6%，病死率為35.5%，嚴重膿毒癥病例的病死率高達50%以上。感染是重要的始動因素，失控的炎癥級聯反應，以及隨之而來的細胞因子風暴和免疫抑制，是膿毒癥不斷進展以及不良預后的關鍵所在，切斷感染發展，成為阻斷器官功能衰竭的重要環節[9]。

1 感染初期CP對病原體的清除及營養免疫作用

在不同環境中，曾三次獨立發現CP，均具有Ca2+結合活性，并與炎癥反應相關，且后續研究中發現，CP對真菌和細菌具有廣譜的生長抑制作用，故得此命名[10]。大多數S100家族的編碼基因聚集在1號染色體長臂的1q21區域[11-12]，在哺乳動物中高度保守，S100蛋白家族成員的氨基酸序列有25%～65%的相似性，但在功能上有所差異。每個單體通常包含C端的經典EF-hand和N端的假EF-hand，由鉸鏈區連接，組成兩個螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix)EF-hand的結構，以反平行的同源/異源二聚體形式存在[13-14]。中性粒細胞胞質中Ca2+濃度較低時(<0.1 μM)，以異源二聚體形式存在的CP，在受到刺激后胞內Ca2+濃度升高約100倍，或從胞質釋放至高鈣離子濃度的胞外時，則將以四聚體形式存在[15]。S100A8、S100A9蛋白質的三級、四級結構見圖1。

注：A為S100A8同源二聚體，單個亞基以紫色和深藍色表示；B為S100A9同源二聚體，亞基以海藍和黃色表示；C為S100A8/A9異二聚體，在兩個旋轉180°的投影中顯示；D為S100A8/A9異四聚體鈣保護素；E為由3個鈣保護素組裝而成的S100A8/A9十二聚體；F為鈣保護素中S100SA8和S100A9的排列示意圖。亞基以單獨的顏色表示，如A和B所示。

1.1 金屬螯合(營養免疫) CP具有卓越的金屬螯合能力。病原微生物感染宿主后，感染部位的宿主細胞將CP釋放到胞外空間，通過EF-hand結構域競爭螯合Fe2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+等病原微生物繁殖所需的微量金屬離子，隔離病原微生物的金屬營養，即通過營養免疫這一先天固有的免疫方式，來限制病原微生物生長增殖。

在感染部位，組織性表達CP的單核/巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞和激活的角質形成細胞[17]，通過主動、被動兩種方式分泌S100A8/A9。主動分泌類似于高爾基體非依賴性細胞因子的分泌，但通常ATP依賴途徑分泌需要完整的微管網絡；被動分泌則多以胞外陷阱方式呈現，體外大約有三分之一的CP通過中性粒細胞胞外陷阱(NETs)釋放[18]。當釋放到感染部位的CP超過該環境下生物有效的金屬離子濃度時，存在于感染部位所有生物可利用的二價過渡金屬離子都可以被CP捕獲。

目前已知影響CP抑菌能力的因素包括但不限于Ca2+濃度、pH以及物理結合，前兩者主要通過調節CP的構象影響其金屬螯合能力實現。研究[19]發現，CP在20 μg/mL的高濃度下對金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的生長起到抑制作用。CP還是唯一已知的可隔離Mn2+的宿主防御蛋白。在Ca2+存在的情況下，抗菌活性在10 μg/mL時變得顯著，Mn2+耗竭為主要抗菌機制。CP使金黃色葡萄球菌失去Mn2+，并抑制其超氧化物歧化酶活性，表明CP通過增加金黃色葡萄球菌對氧化應激的敏感性來減弱其毒力[20]。由于局部水平的Zn2+和Mn2+可以調節CP與包括細菌在內的靶細胞之間的親和力，且CP在不同于Ca2+結合位點的其他結合位點與Zn2+和Mn2+結合[21]，因此在不同的病理狀態下，其抗菌潛力可能存在差異。Ca2+的結合對促炎活性的調節至關重要，CP被釋放到細胞外，在胞外的高鈣環境或Zn2+等陽離子誘導下低聚化[22]，蛋白螺旋和結合環等結構域構象改變[16]，由四聚體發揮生物活性，因此，Ca2+、Zn2+和Mn2+等的結合通過調節蛋白質構象實現其抗菌活性及不同的功能特性。另外可能的影響因素是pH。研究[23]發現S100A12的金屬螯合能力具有pH依賴性，而S100A8/A9異源二聚體與其金屬結合位點相同、基序相似，且與Ca2+結合后Zn2+親和力增強，因此pH變化也可能調節過渡金屬與S100A8/A9的結合。即使S100A8/A9與模式識別受體(PRRs)的結合被抑制時，Zn2+和Mn2+等結合介導的抗菌效應仍可能發生，高水平的CP在感染中起到不可忽視的抗菌作用。不同于耗盡大腸埃希菌胞內的Zn2+和Mn2+，CP通過與細菌物理結合的機制來抑制伯氏桿菌的生長[24]，說明CP除金屬螯合作用外，根據微生物和宿主生態位的不同，尚有其他復雜機制有待探明。

1.2 提高抑菌能力 CP在吞噬細胞NADPH氧化酶的激活中起關鍵作用。在Ca2+存在的情況下，CP與胞質中花生四烯酸結合，并將其轉移到中性粒細胞質膜中的NADPH氧化酶復合物，誘導ROS產生。CP通過激活TNF-α上游的細胞TLR-4來增強吞噬細胞的激活。試驗證明，S100A9通過誘導單核細胞和中性粒細胞中p38、Syk、ERK1/2和PI3K/Akt等磷酸化[25]，提高機體中性粒細胞的吞噬效率，從而增強其對肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的抗菌活性[26]。純化的CP具有廣譜的抗菌活性，包括大腸埃希菌、白念珠菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鼠傷寒沙門菌和單核細胞增生性李斯特菌等[19, 27-28]。黏膜液、氣道分泌物、齦溝液和組織膿腫中存在的CP，有助于限制共生微生物的生長和防止病原體的入侵。三分之一的細菌與表達CP的細胞結合，而在表達CP的細胞中，胞內微生物存在僅占十分之一，這表明胞漿中的CP可以保護其免受牙齦卟啉單胞菌、單核細胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門菌的黏附與侵襲。也有學者認為，CP結合的Ca2+可能破壞生物膜藻酸鹽的聚合，從而增加生物膜表面細菌對中性粒細胞吞噬的易感性[29]。

CP還可通過ROS依賴的方式影響LC3-Ⅱ的轉換，誘導自噬發生，從而促進細胞內牛型結核分枝桿菌的清除，沉默CP會增加牛型結核分枝桿菌的存活率[30]。還有研究[31]表明，在細菌代謝物丁酸鹽存在下，分化的巨噬細胞顯示出增強的抗菌活性，丁酸鹽的存在，驅動了抗微生物 LC3 相關宿主防御及抗微生物肽如CP等產生的協同作用，共同促進細胞抗微生物活性。尚有其他CP誘導的自噬途徑如Beclin1等有待探索[32]。

綜上所述，S100A8/A9在感染初期通過金屬螯合、促進NADPH氧化酶活化和ROS產生、誘導自噬等多重機制抑制感染部位病原體的生長，為吞噬細胞的募集提供時間，此后S100A9增強浸潤的白細胞的吞噬活性，加速病原體的清除。下一步研究應關注CP在體外環境下對中性粒細胞及巨噬細胞的局部作用。

2 CP在膿毒癥發生發展中的作用機制

Ca2+作為第二信使，參與肌肉收縮、細胞分化或死亡的一系列細胞過程，CP復雜的生物學功能，使其既可作為細胞內介質，又可作為細胞外信號蛋白[33]，以旁分泌或自分泌的方式調節靶細胞的活動[34]。膿毒癥的核心機制是機體促炎/抗炎反應動態調控的失衡，由前期的炎癥風暴逐漸轉換成晚期的免疫麻痹。在膿毒癥發生、發展過程中，CP從炎癥的起始階段作為DAMP激活炎性細胞、趨化及放大炎癥的級聯反應，到后期調節促炎介質的產生并捕獲體外促炎細胞因子，其調節炎癥免疫的作用貫穿始終。膿毒癥促炎階段到免疫抑制階段的轉換及特征見圖2。

圖2 膿毒癥促炎階段到免疫抑制階段的轉換及特征

2.1 白細胞趨化的雙向調節 CP在靜息吞噬細胞的微管聚合和穩定中起重要作用。在細胞內，其與p38MAPK和Ca2+信號通路調控微管的相互作用，介導細胞骨架的快速重排，這是細胞成功遷移、吞噬和胞吐的先決條件。

2.1.1 正向調控 S100A8首先被命名為趨化蛋白(CP-10)，是第一個在體內外發現對吞噬細胞具有趨化因子樣活性的S100家族成員，可直接與微管蛋白結合，吸引濃度在10～11 M至10～13 M范圍內的中性粒細胞[35]。動物試驗表明，注射mS100A8可促進白細胞募集，4～6 h出現中性粒細胞，24 h后出現單核細胞，其動力學類似于抗原注入致敏宿主引起的遲發性超敏反應[26]。

S100A9是CP復合物的調節亞基。通過微管網絡分泌的S100A9激活蛋白激酶C，Ca2+依賴性蛋白激酶C水平的升高，促進S100A9的異二聚化和易位到膜，S100A9還可通過p38MAPK途徑消除微管蛋白的聚合[36]。炎癥過程中，S100A9通過Ca2+和p38MAPK信號的磷酸化逆轉微管的形成，導致細胞骨架重排，其主要通過RAGE途徑[25]介導THP1細胞和主要白細胞群的有效遷移。一項癌癥相關試驗[37]表明，Annexin A1蛋白作為細胞骨架重塑因子，可以通過促進細胞遷移/侵入細胞內來調節腫瘤轉移，S100A9則通過Ca2+的收集對Annexin-A1的膜聚集有積極作用。S100A8和S100A9還可以誘導成纖維細胞增殖分化，并與角蛋白絲相互作用，加速傷口修復[38]。

胞質CP與激活的吞噬細胞和上皮細胞中的微管蛋白、微絲和角蛋白、中間絲、F-肌動蛋白等細胞骨架蛋白的相互作用及向質膜的移位都依賴于Ca2+。在吞噬細胞的活化過程中，微管蛋白結合位點較多的四聚體在微管的捆綁和交聯方面優于二聚體，伴隨著Ca2+內流，Ca2+誘導的CP異源四聚體直接與微管結合，在穩定微管網絡中起著關鍵作用，對發揮其胞內生物學功能至關重要[39]。

2.1.2 負向調控 盡管CP在白細胞趨化中作用機制豐富，但在炎癥失控時，尚可起到負向調節作用，即排斥炎癥部位的白細胞，并使巨噬細胞失活。研究[40]證明，S100A8在正常的宿主體內抑制中性粒細胞募集，在體外S100A8和S100A9也對中性粒細胞產生化學排斥效應；然而諸如感染等因素誘發的氧化應激，可能會通過中和其氧化狀態使該活性失效[41]。也有研究[42]發現，對白細胞具有強烈趨化性的是還原的而非氧化的 S100A8 同源二聚體。CP不同功能背后的機制尚不清楚，推測可能由特定的寡聚形式或翻譯后修飾決定其功能。

CP還可以通過上調黏附分子的表達和誘導整合素的激活，來調節白細胞募集的級聯反應。白細胞經歷募集、著邊、捕獲并通過與內皮細胞緊密黏附等一系列過程，產生大量細胞因子，并激活黏附分子所致的內皮損傷，是膿毒癥微循環障礙的主要原因。白細胞滾動過程中的細胞相互作用，觸發CP分泌，CP釋放可誘導內皮細胞表達VCAM-1和ICAM-1[43]，并通過TLR-4介導、RAP1-GTPase依賴的途徑增強白細胞Mac-1(CD11b/CD18)與內皮細胞ICAM-1結合能力，從而降低滾動速度并加強黏附，促進跨內皮細胞遷移[44]。而S100A9敲除(S100A9-/-)的中性粒細胞表現出MAC-1表達受損和通過內皮細胞的遷移能力降低。S100A8和S100A9還可以通過p38信號通路，增加侵襲性偽足的形成和激活促進黏附[45]。這些蛋白也改變了內皮細胞之間的緊密連接，破壞內皮屏障的完整性，降低細胞間連接蛋白cadherin的表達，增加血管的通透性，促進白細胞的外滲，誘導微血管內皮細胞血栓形成和炎癥反應[46]。

2.2 促炎/抑炎的雙向調節 S100A8在細胞外與G蛋白偶聯受體(GPCR)、TLR4、清道夫受體CD36交互；在細胞內則與端粒酶交互；S100A9在胞外作用于RAGE、TLR4、清道夫受體CD36，在胞內調節異源二聚體的活動[17]。二者均具有細胞內外活性，在正常狀態下發揮抗炎作用，氧化應激則激活其促炎功能。

2.2.1 促炎作用 在胞內，CP通過調節NADPH氧化酶的活性，誘導活性氧(ROS)的生成，引發炎癥，同時通過細胞因子轉錄調控的S100A8/A9-NF-κB軸參與中性粒細胞脫顆粒過程[47]，調節多種促炎細胞因子的分泌。在胞外，公認其可作為內源性配體，通過與TLR4或RAGE結合，發揮損傷相關分子模式(DAMP)的作用來調節炎癥過程，并誘導炎性細胞因子、ROS和一氧化氮(NO)產生，從而放大急性和慢性炎癥免疫反應。TLR存在多種亞型，其中TLR2、TLR4是與感染免疫相關的主要受體。 TLR4是首個被發現的TLR蛋白，其受體與病原相關分子模式(PAMP)結合，通過NF-κB信號轉導調控下游炎癥基因，在機體抗炎免疫反應過程中起著重要作用[48]；晚期糖基化終末產物(AGEs)及其受體(RAGEs)則與慢性疾病，尤其是長期炎癥有關。

CP主要經NF-κB途徑調節細胞因子分泌，通過TLR4信號激活髓分化因子88(MyD88)，TIRAP/MyD88復合物將IL-1R相關激酶(IRAKs)和 TNF-α受體相關因子6(TRAF6)募集到受體，激活TAK1后，使IKKs磷酸化，然后IκB與NF-κB分離，NF-κB易位誘導促炎細胞因子(IL-6、IL-8 和 TNF-α等)的轉錄[49]。因此，CP不僅是反應炎癥的生物標志物，而且還通過多種功能促進炎癥過程的進展，在炎癥性疾病的病理生理學中具有重要意義。

研究[50]表明，S100A8和S100A9在體內外均能促進單鈉尿酸鹽(MSU)晶體誘導吞噬細胞中IL-1β的分泌，用S100A9處理人單核細胞也出現IL-1β、IL-6和TNF-α分泌增加[51]；在fMLP和GM- CSF刺激的中性粒細胞中，S100A9可以分別間接增強NF-κB、CREB-1和STAT3/STAT5途徑的IL-8分泌[52]，S100A9還可能充當壞死性凋亡信號的下游參與者，在肝臟的壞死性炎癥軸中發揮作用[53]。

炎癥失衡狀態下，S100A8/A9的過度表達可繼續放大炎癥反應，加速中性粒細胞和巨噬細胞釋放更多的細胞因子，從而導致惡性循環。還有學者用甲型流感病毒(IAV)感染小鼠[54]，發現由DDX21-TRIF途徑誘導的S100A9，通過TLR/MyD88從未受損的巨噬細胞中釋放出來，可以單獨作為促炎因子激活TLR，導致過度的炎癥反應和細胞凋亡。目前推測，細胞外S100A9調節炎癥反應獨立于細胞內S100A9，作為有效病毒感染/復制所需的宿主因子起效。有試驗證明使用小分子靶向抑制劑或抗體(Narciclasine、CAP37等)阻斷CP活性或下游信號通路可減少促炎細胞因子的分泌，減輕過度炎癥，改善感染和損傷狀況[55-57]，因此這種異源二聚體具有作為治療靶點的潛力。

2.2.2 抗氧化損傷與抑炎作用 盡管S100蛋白的過度表達與疾病的惡化密切相關，但適當水平的S100蛋白可能有助于防御能力和免疫穩態。與前文促進ROS形成相反，S100A8同時具有強大的氧化劑清除活性。研究[58]表明，S100A8能通過清除活化白細胞產生的 ROS 來抑制IgE介導的MC脫粒和IL-6、IL-4、GM-CSF等細胞因子的產生，外源性S100A8蛋白可以抑制血小板衍生生長因子(PDGF)誘導的氣道平滑肌細胞(ASMC)增殖，在減少和逆轉慢性呼吸道疾病氣道重塑的治療中存在開發價值。S100A8還可促進氣道上皮細胞抗炎因子IL-10的表達，降低脂多糖(LPS)誘導的促炎因子表達和中性粒細胞浸潤。在免疫調節作用方面，同源二聚體S100A8比CP異源二聚體更有效，而Ca2+誘導(S100A8/A9)2四聚體的形成隱藏了 TLR4 結合位點并阻斷異二聚體進一步結合 TLR4的能力，從而防止不良的全身效應[59]。

許多不同的研究也揭示了CP在特定條件下控制失控炎癥、避免過度炎癥造成組織損傷的保護作用。CP與促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的非共價和高親和力結合表明，CP具有捕獲細胞因子的能力[60]。研究[61]發現，在感染所致的不穩定慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者中，S100A9的表達未見增加，這可能是機體免疫功能低下的表現，是疾病惡化的原因；其他因素誘發的重度COPD患者S100A9高表達，提示免疫反應失控。研究[62]將S100A8/A9和S100A9單體以鼻內吸入方式給藥小鼠，發現由LPS引起的急性肺損傷(ALI)中的中性粒細胞流入有所改善， LPS介導的ALI信號通路轉導受到抑制，S100A9的預處理可能有助于正常的肺內穩態和防止過度暴發性炎癥，減輕急性肺損傷。還有研究[63]表明，甲基強的松龍顯著增加患者血清中CP表達水平，并通過GR β信號傳導使骨髓源性抑制細胞擴增，從而緩解急性期多發性硬化癥癥狀。

綜上所述，不同狀態的S100A8、S100A9和S100A8/A9參與了炎癥過程中體內穩態的調節和恢復，是維持炎癥過程動態平衡的關鍵靶點，目前對其抗炎的具體機制所知甚少，在膿毒癥期間阻斷可溶性CP形成或分泌、調節其磷酸化修飾及氧化應激狀態，構建針對性的疫苗，誘導的自身耐受和交叉耐受可能為預防膿毒癥期間炎性因子風暴提供一種新策略。

3 展望

目前CP水平升高是炎癥性疾病的特征，但現有研究對異二聚體、同源二聚體和異源四聚體混合物功能分別分析的固有困難，使CP的研究仍較為局限，關于S100A8、S100A9單體及其多種寡聚體(同源/異源二聚體、四聚體、六聚體等)存在形式的不同水平，以及在不同形式之間相互轉換的條件將是解釋其行為功能的關鍵。暫時地控制S100A8/A9的作用，通過有條件的控制基因表達或藥物抑制S100A8/A9或其受體，或對S100A9進行細胞特異性敲除，從特定的細胞來源確定S100A8/A9表達的重要性，是進一步研究的主要手段，CP不僅可以作為炎癥相關疾病的診斷和預后的生物標志物，還可以作為疾病療效的檢測指標，這一領域未來的發展方向在挖掘其潛在機制的基礎上，可能集中在針對CP作為早期疾病檢測和預后的生物標志物，以及驗證CP在臨床前和臨床環境中的治療潛力及相關治療方法的開發。期待未來能在疾病不同階段、不同部位對CP發揮的作用進行區分調控，實現精準醫療的目的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。