免疫評分對低級別膠質瘤患者生存期的預測作用

陳 平,王占峰

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；2.南華大學附屬第二醫院，湖南 衡陽421000)

膠質瘤是常見的中樞神經系統腫瘤，占所有原發性中樞神經系統惡性腫瘤的80.8%；而低級別膠質瘤(LGG)是常見的膠質瘤之一，占所有膠質瘤的16%[1],LGG包括Ⅱ級和Ⅲ級星形細胞瘤和少突膠質細胞瘤[2]。雖然LGG的預后要好于高級別膠質瘤(如膠質母細胞瘤)，但近70%的LGG在10年內發生進展[3]。LGG具有較強的侵襲性，目前難以做到完全治愈。腫瘤微環境(TME)由大量不同數量的免疫細胞、基質細胞和其他非腫瘤成分組成，在腫瘤的發生和發展中起著關鍵作用[4]。免疫治療是目前膠質瘤治療的研究熱點，近年來越來越多的研究表明免疫浸潤與膠質瘤的預后相關[5-6]。因此，本研究擬建立一個科學的預測模型來預測預后，以期能篩選出LGG中的高位人群并盡早干預。

1 資料與方法

1.1 數據獲取

TCGA是目前可用于腫瘤基因組分析的最大數據集，包括至少200種癌癥和臨床信息，以及DNA甲基化、RNA測序等測量(https://cancergenome.nih.gov/)。本研究通過訪問cbioportal數據庫(http://www.cbioportal.org/)下載LGG患者TCGA的臨床病理信息，包括患者的唯一編號、年齡、性別、病理診斷、分期、總生存期(OS)及OS時間。通過基因表達數據計算免疫評分，并使用免疫評分來估計浸潤免疫細胞的水平。本研究通過美國德州大學MD安德森癌癥中心的數據庫(https://bioinformatics.mdanderson.org/)下載LGG的免疫評分。依據在刪除重復病例及剔除不完整數據后，最終有514例LGG患者納入本研究。所有患者的診斷均依據病理結果，其中星形細胞瘤(astrocytoma)194例、少星形細胞瘤(Oligoastrocytoma)129例及少突膠質細胞瘤(Oligodendroglioma)191例。514例患者中男性患者284例，女性患者230例，年齡14-87歲，平均年齡(42.95±13.37)歲。

1.2 統計分析

本研究使用X-tile 3.6.1軟件(美國康涅狄格州紐黑文耶魯大學醫學院)獲得免疫評分的分界點，并做了X-tile圖對免疫分數進行評估。分類數據用卡方檢驗或Fisher檢驗進行分析，連續變量用方差檢驗(ANOVA)或Kruskal-Wallis H檢驗對分布異常和方差同質的變量進行分析。使用Kaplan-Meier方法構建生存曲線，并使用對數秩檢驗進行比較，以了解不多免疫評分亞組之間生存是否存在差異。多變量Cox比例風險回歸模型用于確定OS的獨立預測因子。在同時考慮年齡、性別、病理診斷結果和腫瘤分期的影響后，估計了調整后的危險比(HR)和95%置信區間(CI)。

使用根據多因素分析的結果繪制列線圖。這些列線圖經過1 000次bootstrap自助法抽樣，用于分析數據庫的內部驗證。通過計算一致性指數(C-index)來評估預測預后模型的性能。C-index在0.5-1之間，1為理想狀態,說明該模型預測結果與實際完全一致，0.5則相反，說明該模型沒有完全預測作用。通過比較觀察到的生存率和模型預設的生存率，繪制了3年、5年OS的校準曲線及計算時間依賴性受試者工作特征(ROC)曲線以評估模型的預測效能。所有統計檢驗均為雙側檢驗，P值<0.05被認為差異具有統計學意義。上述所有的統計分析及作圖均在R軟件(4.1.1版，https://www.r-project.org/)中完成。

2 結果

2.1 免疫評分分組

數據整理后，共有514名患者被納入研究中。免疫評分的分界點為-1184.9和303.4，患者隨后被分為高、中、低免疫評分3個亞組(X-tile圖如圖1所示)。共有117例(22.76%)患者低于或等于-1184.9(低免疫評分亞組)，327例(63.62%)介于-1184.9和303.4(中等免疫評分亞組)之間，70例(13.62%)名患者高于303.4(高免疫分數亞組)。

圖1 X-tile圖顯示截斷值

2.2 OS的多因素COX比例回歸風險分析

如圖2和圖3所示，免疫評分低、中、高的患者在OS方面存在顯著差異。多變量Cox比例風險回歸分析結果如圖2所示。與免疫評分低的患者相比，免疫評分中及高的患者顯著增加了OS的風險，其HR及95% CI分別為1.88(1.08-3.3)、3.26(1.66-6.4)。腫瘤分期也是影響OS的關鍵因素，相比于G2期，G3期患者的OS風險明顯增加，HR值為2.38(95%CI，1.58-3.6)。年齡對OS的影響正如預期的一樣，相比于小于或等于40歲的較年輕的患者而言，其他年齡段的患者隨著年齡的增長其生存風險也明顯增加。不同年齡段的風險比如下：41-50歲的患者HR為1.94(95%CI，1.14-3.3)，51-60歲的患者HR為3.40(95%CI，1.99-5.8)，大于60的患者HR為7.62(95%CI，4.56-12.7)。而性別及膠質瘤的病例類別對于OS未產生明顯的影響。

圖2 森林圖展示多因素COX回歸分析的結果

圖3 Kaplan-Meier曲線描述了免疫評分亞組與LGG患者總生存率(OS)的關聯

2.3 OS的預后列線圖

圖4顯示了綜合考慮了OS的所有獨立因素的預后列線圖。OS預測的C-index為0.8，95%CI為0.759-0.841。3年、5年ROC曲線下面積(AUC)值分別為0.844及0.795(圖5)。3年、5年生存概率的校準圖(圖6A及6B)顯示，列線圖預測結果與實際觀察結果吻合良好。

圖4 LGG生存列線圖

圖5 3年、5年OS的ROC曲線

3 討論

本研究利用LGG患者的基因表達數據評估了免疫評分的預后意義，在考慮了可能的混雜因素后發現免疫評分與LGG患者的OS顯著相關。同時建立了列線圖，以便能夠簡單直觀的預測LGG患者的生存率。

免疫細胞對膠質瘤的作用已得到確認[7]，并且免疫基因標記被認為是免疫治療反應的生物標志物。目前已有一些研究表明基因免疫特征與膠質瘤的預后密切相關，如Zhang等[6]篩選16個免疫相關基因的表達量來進行評分，并以此評分的高低將膠質瘤分成高低兩組，隨后的分析發現評分的高低與預后密切相關。通過檢測一些基因的表達來對患者的預后做出一些初步的評估，但這些挑選的基因無法全面而真實反映腫瘤的免疫浸潤情況，且單純依據中位數或者均數的截斷值劃分高低位組也不確切。因此，采用ESTIMATE算法[8]來計算LGG的免疫評分，能夠較為準確反映LGG的免疫細胞的水平，同時根據研究目的來選取截斷值，并探討免疫評分與LGG預后的關系。

圖6 LGG患者5年和3年總生存率(OS)的校準曲線

在排除可能的混雜因素后，免疫評分越高，LGG患者的OS越差，兩者呈負相關，這與之前的研究結果相一致[9]；與本研究結果相反的是在許多其他類型的腫瘤中(包括肺癌、結腸癌及黑色素瘤)，免疫浸潤與OS呈正相關[10-12]。為什么會呈現這種截然不同的結果，有以下可能的原因。其一，LGG患者中存在IDH突變的預后更好[13]，而IDH突變可導致腫瘤代謝物2-羥基戊二酸(2-HG)的產生[14]。2-HG是被認為是一種免疫抑制劑，可創造了一個免疫抑制的腫瘤微環境[15]。其二，高免疫評分LGG患者的腫瘤微環境可能主要浸潤抑制性免疫細胞[16]。研究發現，在免疫高風險組中積累了更多的免疫抑制細胞(MDSC、Treg和成纖維細胞)、免疫抑制細胞因子(CCL5、CCL22和IL-10)和免疫檢查點分子(PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3和BTLA)，這些細胞在免疫激活后可以逃避免疫識別和清除[5]。其三，在免疫抑制的腫瘤微環境中，可能出現腫瘤干細胞減少[17]，從而導致低免疫評分LGG患者OS的提高。

本研究基于免疫評分和臨床病理特征預測LGG患者OS的列線圖。通過這些評分系統，可對患者實現個體化的生存預測，盡早識別高風險人群，盡早干預以改善預后。目前包括可用于計算免疫評分的基因表達文件在內的數據集很少，因此本研究的列線圖未能進行外部數據驗證。今后應進一步收集與免疫基因表達相關的數據，以及納入更多的臨床病理因素。