COX-2和CEA在大腸癌中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)

張 輝，王朝暉

(大連市中心醫(yī)院 1.消化內(nèi)科;2.病理科，遼寧 大連110613)

大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌，每年約有90萬人因患大腸癌導(dǎo)致死亡，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的提高，大腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高。雖然早期大腸癌可以治愈，但中晚期大腸癌的5年生存率很低，因此，早期大腸癌的病理學(xué)診斷和早期精準(zhǔn)手術(shù)治療對(duì)提高大腸癌的治愈率至關(guān)重要。以往研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧合酶-2(cyclooxyganese-2，COX-2)在食管癌等腫瘤組織中均可異常表達(dá)，其在腫瘤微環(huán)境形成過程中具有重要作用，且與腫瘤的浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)作為廣譜腫瘤標(biāo)志物，其在血清中的升高與腫瘤的細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。因此，本文采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)COX-2和CEA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以探討其與大腸癌的臨床生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)性，為今后臨床診斷、治療以及預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究樣本分為3組，均于2017年7月至2019年7月期間收集自大連市中心醫(yī)院病理科，其中，大腸癌組50例，為外科手術(shù)切除的大腸癌完整石蠟組織塊，正常大腸組織50例，取自大腸癌遠(yuǎn)端部位距腫瘤邊緣15 cm外，大腸腺癌組織50例，取自消化內(nèi)鏡活檢。入組標(biāo)準(zhǔn)：具有完整的病史與病理資料，術(shù)前均未進(jìn)行抗癌藥物和放、化療治療，本研究病例按照2000年WHO腸道腫瘤學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大腸癌進(jìn)行診斷和分級(jí)，病理分期以Ducks分期為標(biāo)準(zhǔn)。A期：腫瘤局限于黏膜和黏膜下層；B期：腫瘤穿透腸壁，但無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；C期：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；D期：有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究中大腸癌組包括男性26例，女性24例，平均年齡約為50.1歲，其中高于50歲者25例；按照腫瘤分化程度可分為高分化14例，中分化16例，低分化20例；按照Dukes分期，A+B期22例，C+D期28例；按照淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度可分為：淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移23例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性27例。以上所有樣本的收集均獲得患者知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：鼠抗人COX-2濃縮型單克隆抗體，鼠抗人CEA濃縮型單克隆抗體，Envision反應(yīng)液，以上產(chǎn)品均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；DAB顯色劑，PBS溶液，檸檬酸修復(fù)液，抗體稀釋液和濃度梯度酒精等由大連市中心醫(yī)院病理科免疫組化室提供。主要儀器：O1ympus顯微鏡 BX40(日本奧林巴斯)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、組織脫水機(jī)(德國徠卡ASP300)、包埋機(jī)(德國徠卡EG1140H)、切片機(jī)(德國徠卡)、YWY831型醫(yī)用微波爐(上海)、醫(yī)用冰箱(江蘇蘇州)、電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械第五廠)。

1.3 免疫組織化學(xué)

組織蠟塊經(jīng)切片機(jī)切成厚度為4 μm，將石蠟切片置入65℃烤箱中烘烤2 h，脫蠟后浸入蒸餾水，1×PBS沖洗3～5次，浸入檸檬酸修復(fù)液置入高壓鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗3～5次，3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS沖洗3～5次，加入一抗(1∶1 000)，37℃孵育1 h，PBS沖洗3～5次，加入二抗溶液，37℃孵育20 min，PBS沖洗3～5次，應(yīng)用DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗后復(fù)染、脫水、透明和封片，置于顯微鏡下觀察。

免疫組化染色的結(jié)果采用以下判斷標(biāo)準(zhǔn)判讀：陽性細(xì)胞中COX-2和CEA蛋白表達(dá)定位在細(xì)胞漿，染色呈棕黃色顆粒，記數(shù)10個(gè)高倍視野染色陽性細(xì)胞所占總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。陽性染色細(xì)胞0%～10%為“-”、10%～25%為“+”、25%～50%為“++”、50%～100%為“+++”。(每一個(gè)切片都是先在低倍鏡下找到陽性細(xì)胞密集區(qū)域，然后用高倍鏡下10×40，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，組間COX-2和CEA的表達(dá)率與基本信息資料以及臨床生物學(xué)特性之間的關(guān)聯(lián)應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，COX-2和CEA的表達(dá)率的相關(guān)性采用Spearman關(guān)聯(lián)性分析法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2和CEA在大腸腺癌組織、大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織中的表達(dá)

COX-2在大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織中表達(dá)率分別為80%、48%和0%，COX-2在大腸癌組織中的表達(dá)明顯高于大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CEA在大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織中表達(dá)率分別為76%、46%和0%，CEA在大腸癌組織中的表達(dá)明顯高于大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。COX-2在大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織中的表達(dá)情況見圖1，CEA在大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織中的表達(dá)情況見圖2，兩種蛋白的表達(dá)率見表1。

圖1 COX-2在大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織中的表達(dá)

圖2 CEA在大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織中的表達(dá)

表1 大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織中COX-2和CEA的表達(dá)

2.2 COX -2和CEA的表達(dá)水平與大腸癌臨床生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)

通過分析COX-2的表達(dá)與大腸癌患者臨床生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)性(表2)，結(jié)果表明：COX-2的表達(dá)與大腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes’分期程度相關(guān)，其中，COX-2表達(dá)隨著大腸癌分化程度的降低而增高(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的COX-2的陽性率高(P<0.05)，處于C期和D期的大腸癌組織中COX-2的表達(dá)明顯高于A期和B期腫瘤組織(P<0.05)。此外，COX-2在大腸癌中的表達(dá)與患者性別、年齡和腫瘤部位無明顯相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 COX-2、CEA在大腸癌組織中的生物學(xué)特性的關(guān)系

通過分析CEA的表達(dá)與大腸癌患者臨床生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)性(表2)，結(jié)果表明，CEA的表達(dá)與大腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes’分期程度相關(guān)，其中，CEA表達(dá)隨著大腸癌分化程度的降低而增高(P<0.05)，處于C期和D期的大腸癌組織中CEA的表達(dá)明顯高于A期和B期腫瘤組織(P<0.05)。與COX-2相同的是，CEA在大腸癌中的表達(dá)與患者性別、年齡和腫瘤部位無明顯相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 COX -2和CEA在大腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

通過分析COX-2和CEA兩種蛋白質(zhì)在大腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性(表3)，結(jié)果顯示，兩種蛋白質(zhì)標(biāo)記物均為陽性的樣本高達(dá)36例，且COX-2和CEA兩者之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(r=0.656,P<0.05)，COX-2和CEA在大腸癌的進(jìn)展中都呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。

表3 COX-2和CEA表達(dá)在大腸癌中的相關(guān)性分析

3 討論

大腸癌作為常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增高，具有多發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差和生存率低等特點(diǎn)，大腸癌的發(fā)生發(fā)展較為復(fù)雜，部分大腸癌由大腸腺瘤發(fā)展而來，并且，早期大腸癌的內(nèi)鏡診斷往往無法觀察腫瘤細(xì)胞的細(xì)微改變，特別是對(duì)于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移無法準(zhǔn)確判斷，因此，選取特異性表達(dá)的分子指標(biāo)，對(duì)大腸腺瘤和大腸癌進(jìn)行早期病理診斷，對(duì)明確腫瘤性質(zhì)、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床生物學(xué)特征具有重要意義。

COX-2是一種誘導(dǎo)酶，即誘生型環(huán)化酶，屬于即早蛋白，在機(jī)體處于病理狀態(tài)下或者細(xì)胞組織損傷時(shí)，COX-2可以被快速激活[3]，從而參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、阻止細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，抑制患者免疫機(jī)制，加快腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，研究表明，COX-2在大腸癌中的過表達(dá)會(huì)增加其對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥性，流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)長期服用非甾體類抗炎藥的成人，其結(jié)直腸癌的發(fā)病率下降40%～50%，可見，COX-2 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[3]。研究表明[4]，COX-2在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白基因(APC)的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，潘貽飛等[5]研究表明COX-2在大腸癌組織中表達(dá)較高，且其表達(dá)程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期存在明顯相關(guān)性，值得一提的是在該研究中COX-2的表達(dá)與血清CEA呈現(xiàn)正相關(guān)。與以上多個(gè)研究相同的是，本研究中COX-2在大腸癌中呈高表達(dá)，明顯高于大腸腺瘤組，而在大腸正常黏膜無明顯表達(dá)，通過分析COX-2的表達(dá)與大腸癌臨床生物學(xué)特征的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示，COX-2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期有明顯相關(guān)性，而與年齡、性別和腫瘤發(fā)生部位無相關(guān)性，而與潘貽飛等[5]的研究不同的是，該研究發(fā)現(xiàn)COX-2在大腸癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性，可能是由于樣本過少和實(shí)驗(yàn)診斷具體標(biāo)準(zhǔn)不同所導(dǎo)致。以上研究結(jié)果表明，COX-2在大腸癌和大腸腺瘤中表達(dá)異常升高，且與腫瘤遷移和惡性程度具有明顯關(guān)聯(lián)性，說明COX-2的過表達(dá)是大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中重要環(huán)節(jié)，因此，COX-2不僅可以作為早期大腸癌診斷的標(biāo)記物，同時(shí)可以作為抗腫瘤的藥物作用靶點(diǎn)。

CEA是一種具有胚胎抗原決定簇的大分子酸性蛋白，在內(nèi)胚層來源的惡性腫瘤中均可出現(xiàn)[6-7]。CEA是一種常見的血清腫瘤標(biāo)記物，研究表明，CEA在血清中含量的升高與腫瘤組織中多種蛋白的表達(dá)呈明顯相關(guān)性，不僅如此，CEA在大腸癌組織中同樣存在異常表達(dá)，國內(nèi)有研究證實(shí)，結(jié)腸癌中CEA的高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性[8]，并且，CEA在結(jié)腸癌中的表達(dá)程度對(duì)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后的評(píng)估具有重要價(jià)值[9]。本研究結(jié)果顯示，CEA在大腸癌和大腸腺癌中的表達(dá)高于正常大腸組織，其在大腸癌中的高表達(dá)與腫瘤分化程度和Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性，而與年齡、性別和腫瘤發(fā)生部位無明顯相關(guān)性。以上研究結(jié)果表明，CEA不僅可以作為結(jié)直腸癌診斷的腫瘤標(biāo)記物，其在大腸癌和大腸腺瘤組織中的表達(dá)同樣與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及嚴(yán)重程度相關(guān)，可以作為大腸癌的早期篩查和病理學(xué)診斷的分子靶標(biāo)。

綜上所述，本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)大腸癌中COX-2和CEA蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并分析兩種蛋白的表達(dá)與臨床生物學(xué)特性之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，COX-2和CEA蛋白的在大腸癌中呈正相關(guān)性高表達(dá)，且其表達(dá)程度與大腸癌的臨床生物學(xué)特性存在不同程度的相關(guān)性，可以作為大腸癌的早期篩查、診斷的重要指標(biāo)，以期為大腸癌的早期治療、科學(xué)用藥、輔助化療或生物靶向治療提供有效數(shù)據(jù)。