外周血Th17/CD4+CD25+CD127lowTreg細胞區分活動性肺結核和潛伏期結核合并肺炎

汪永強，劉世軍，李顯勇，鄒同會，羅 靜，游佳蓉，楊玉霖

(1.四川省內江市第二人民醫院 檢驗科，四川 內江641001；2.四川省內江市第二人民醫院 感染性疾病科，四川 內江641001)

根據世界衛生組織報道，全球1/3的人感染過結核分枝桿菌，且每年約1.7百萬死于結核和結核相關疾病，2016年全球報道共有1.04百萬新確診結核病例，1.674百萬死亡結核病例[1-3]。目前缺乏潛伏期結核的診斷標準，由潛伏性結核發展為活動性結核的風險顯著增加，因此結核的早診斷、早治療是控制結核病的主要措施[4]。γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRA)采用了早期分泌抗原6(early secretory antigenic target-6，ESAT-6)和培養濾液蛋白10(culture filtrate protein 10,CFP-10)、TB7.7抗原合成肽作為結核分枝桿菌特異性抗原，相較于TST檢查，IGRA具有較高的特異度。然而單獨的IGRA區分活動性肺結核和潛伏期結核的能力仍然有限[5-6]。

活動性肺結核的早期臨床表現與非結核肺炎的臨床表現通常難以區分，這樣可能會導致病情的延誤[7]，單獨的IGRA不能區分活動性肺結核和潛伏期結核。因此，尋找新的生物標志物用于區分活動性肺結核和潛伏期結核合并肺炎是很有必要的。

當前大家更多地關注活動性肺結核和潛伏期結核的生物標志物，其中IP-10更具有區分LTBI和活動TB潛在的能力[6,8]。然而這些研究沒有將潛伏期結核合并肺炎納入對照。有報道IL-17與IL-23不論是外周血單個核細胞基因表達層面，還是在CD4+T淋巴細胞蛋白表達層面，在活動性肺結核表達均低于潛伏期結核[9]，該結果可能與PD-1、Th2以及免疫調節細胞Treg升高有關[10]，提示是一個潛在的區分標志物，但尚無評價區分活動性肺結核和潛伏期結核合并肺炎的價值。本研究以IGRAs為診斷的基礎上，將納入患者分為活動性肺結核、LTBI+肺炎組與LTBI-肺炎組，探討和評價外周血Th17/CD4+CD25+CD127lowTreg區分活動性肺結核和LTBI合并肺炎的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1研究對象 2018年2月至2020年1月內江市第二人民醫院感染科疑似肺結核住院患者131例納入研究，因臨床資料或實驗室數據不全排除41例，1例涂片陽性PCR陰性患者后經基因芯片檢測確診為非結核分枝桿菌感染而排除，共89例最終納入研究對象。活動性肺結核的診斷依據臨床癥狀、肺部影像學表現、呼吸道標本結核涂片、痰液、支氣管肺泡灌洗液培養或核酸PCR檢查結果。按照中國國家衛健委《肺結核診斷標準WS288-2017》,納入的41例活動性結核病例中，其中11例為結核培養陽性確診病例，8例為結核呼吸道標本PCR擴增陽性病例，臨床確診病例22例依據臨床癥狀、肺部影像學表現、結核抗體、γ干擾素釋放試驗，并經抗結核治療有效而診斷。48例先前疑似結核患者，最后因診斷為肺炎排除活動性結核，其中21例肺炎患者按照γ干擾素釋放試驗陽性列為LTBI+肺炎組，27例肺炎患者按照γ干擾素釋放試驗陰性列為LTBI-肺炎組。活動性結核組、LTBI+肺炎組、LTBI-肺炎組年齡中位數(范圍)分別為53歲(16-79)、64歲(25-83)、51歲(16-83)。χ2=6.190，P=0.045；男女比分別為36/5、11/10、18/9，χ2=1.313，P=0.519。

1.1.2γ干擾素釋放試驗 用含肝素抗凝劑的真空管采集患者全血，在16 h內將采集的全血顛倒混勻后分裝到N、T、P(N:空白對照管,Nil；T：ESAT-6/CFP-10抗原刺激,TB-Ag；P：絲裂原刺激,Mitogen)3個培養管中，每種培養管加入全血1 ml，將培養管輕柔顛倒混勻5次后放入37℃培養箱培養22±2 h，將培養后的全血以3 000～5 000 r/min離心10 min，取血漿進行化學發光法檢測IFN-γ，整個操作嚴格按照說明進行(結核分支桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒、化學發光法、中國廈門萬泰凱瑞)。

1.1.3Th17/CD4+、Treg/CD4+全血流式細胞檢測 用EDTA-K2抗凝全血，在試管中加入10 μl熒光抗體混合物和100 μl的抗凝全血，渦旋混勻后室溫避光孵育20 min，加入500 μl Optilyse C紅細胞裂解液，渦旋混勻后室溫避光放置10 min，直至血液透亮，加入PBS，室溫避光5 min，加入100 μl已充分混勻的Flow-count絕對計數微球，渦旋混勻后應用流式細胞儀，用Beckman coulter軟件分析數據。操作流程嚴格按照Beckman coulter試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 研究對象人口學特征及臨床特征比較活動性結核組、LTBI+肺炎組、LTBI-肺炎組年齡中位數分別為53歲(16-79)、64歲(25-83)、51歲(16-83)。χ2=6.190，P=0.045；男女比分別為36/5、11/10、18/9，χ2=1.313，P=0.519。γ干擾素釋放試驗陽性分別為37例(90.2%)、21例(100%)、0例(0%)。在合并并發癥方面，3組之間無統計學意義(P>0.05),41例活動性肺結核中具有CT空洞影像學改變16例，雖然在LTBI+肺炎組和LTBI-肺炎組CT影像學表現為炎癥現象，但未發現空洞現象。在白細胞計數、血紅蛋白含量、血沉、血清白蛋白在3組之間均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 外周血液細胞參數及淋巴細胞亞群比較為了探討區分活動性肺結核、LTBI+肺炎的診斷指標，比較了活動性結核組、LTBI+肺炎、LTBI-肺炎3組之間外周血C反應蛋白(CRP)及各白細胞亞群及比值、外周血流式細胞術檢查Th17/CD4+、調節免疫細胞Treg/CD4+以及Th17/Treg比值在區分活動性結核和LTBI+肺炎患者的價值，結果表明：CRP、Lym/WBC、Lym/Mon、Lym/Neu、Th1/CD4+T、Th2/CD4+T、Treg/CD4+T在3組之間均無統計學意義(P>0.05)，圖1。Th17/CD4+在3組中的平均數分別為1.17±0.77、2.30±0.91、1.78±1.08，三者之間具有統計學意義，F=11.312，P=0.000(Active TB vs LTBI+pnet=-4.708,P=0.000;Active TB vs LTBI-pnet=-2.723,P=0.008;LTBI+pne vs LTBI-pnet=1.962,P=0.054)，Th17/Treg在3組中的中位數(中位數，四分位間距)分別為0.300(0.155-0.530)、0.570(0.400-1.090)、0.420(0.270-0.680),χ2=10.352，P=0.006(Active TB vs LTBI+pneχ2=9.760,P=0.002；Active TB vs LTBI-pneχ2=3.236,P=0.072;LTBI+pne vs LTBI-pneχ2=1.911,P=0.167)。圖1～圖3，結果表明Th17/CD4+和Th17/Treg在LTBI+pne 和 LTBI-pne之間無統計學意義，但有可能是區分活動性肺結核和LTBI+肺炎的診斷指標。

圖1 外周血白細胞及淋巴細胞亞群在3組中的水平

圖2 活動性肺結核組Th17/CD4+流式圖

圖3 活動性肺結核組Treg/CD4+T流式圖

2.3Th17/CD4+、Th17/Treg區分活動性肺結核和非結核性肺炎的ROC曲線 以肺炎(LTBI+肺炎和LTBI-肺炎)為對照，Th17/CD4+和Th17/Treg區分活動性肺結核和非結核肺炎(不論是否為合并潛伏期結核)的ROC曲線下面積為：AUC=0.7485(P<0.0001)與AUC=0.6796(P=0.0036)，圖4。依據ROC曲線計算各診斷指標的正確診斷指數(Youden指數)，當Th17/CD4+<2.125為cut-off值時，診斷靈敏度為87.80%(36/41)，誤診率為47.92%(23/48),當Th17/Treg<0.355為cut-off值時，診斷靈敏度為63.41%(26/41)，誤診率為31.25%(15/48),其它診斷價值如圖5、表3,顯然Th17/CD4+和Th17/Treg區分活動性肺結核和非結核肺炎的價值不理想。

圖4 外周血Th17/CD4+與Th17/Treg區分活動性肺結核和LTBI+Pne的ROC曲線

圖5 外周血Th17/CD4+與Th17/Treg區分活動性肺結核和LTBI+Pne最佳診斷點和陽性病例

表1 Th17/CD4+與Th17/Treg區分Active TB和肺炎以及Active TB和LTBI+Pne

當以LTBI+肺炎患者為參照，Th17/CD4+和Th17/Treg診斷活動性肺結核的ROC曲線下面積為：AUC=0.8287(P<0.0001)與AUC=0.7439(P<0.0018)，圖4。當Th17/CD4+<1.060為cut-off值時，診斷靈敏度為51.22%(21/41)，誤診率為4.76%(1/21),當Th17/Treg<0.3550為cut-off值時，診斷靈敏度為63.41%(26/41)，誤診率為14.29%(3/21)，圖5、表1，對于區分活動性肺結核和LTBI+pne患者，顯然用只用約登指數判斷最佳分界點并不符合臨床，若以診斷活動性肺結核靈敏度大于85%為標準，ROC曲線顯示Th17/CD4+的cut-off值為小于2.10，其診斷活動性肺結核靈敏度為85.37%，特異性為57.14%。Th17/Treg的cut-off值為小于0.680，其診斷活動性肺結核靈敏度為85.37%，特異性為33.33%。表明以TB-IGRAs為診斷第一步，用外周血Th17/CD4+區分活動性肺結核和LTBI+肺炎有一定的診斷價值。

3 討論

本研究目的是通過比較外周血白細胞參數區分活動性肺結核和潛伏期結核合并肺炎患者，結果發現Th17/CD4+和Th17/Treg區分活動性肺結核和非結核肺炎(不論是否為合并潛伏期結核)的ROC曲線下面積為：AUC=0.7485與AUC=0.6796，以正確度計算診斷的cut-off值，兩者區分活動性肺結核和非結核肺炎的敏感度為診斷靈敏度為87.80%和63.41%，但誤診率達到47.92%和31.25%，顯然價值不高。但Th17/CD4+區分活動性肺結核和LTBI+Pne的ROC曲線下面積為：AUC=0.8287，診斷靈敏度為51.22%(21/41)，但誤診率只為4.76%。若以診斷活動性肺結核靈敏度大于85%為標準，ROC曲線顯示Th17/CD4+的cut-off值為小于2.10，其診斷活動性肺結核靈敏度為85.37%，特異性為57.14%。表明Th17/CD4+在IGRAs試驗基礎上，進一步區分活動性肺結核和LTBI+Pne具有一定的應用價值。

當前，活動性肺結核的診斷主要依靠臨床診斷，病原學診斷中結核培養雖然作為診斷的金標準，但培養周期太長不適合于早期診斷[3]，IGRA雖然是基于T淋巴細胞再次免疫應答全新的免疫學診斷方法，已經被多個國家納入到結核病診斷指南[11-12],然而該方法存在的主要問題是不能區分活動性肺結核和潛伏期結核。在結核高負擔的國家如中國，在沒有活動性肺結核人群中，T-SPOT陽性率達到43.6%[13]，本研究48例非活動性結核患者中，IGRA陽性21例，陽性率43.75%，表明單純用IGRA診斷活動性肺結核在中國并不適用。

很多的研究把焦點集中在尋找新的標志物，用于區分活動性肺結核和潛伏期結核的研究，在細胞因子方面，IL-2/IFN-γ比值區分活動性肺結核和潛伏期結核的敏感性為77.2%，特異性為87.2%[14]；Jeong等報道結核特異性與有絲分裂原刺激后IP10比率區分活動性結核和潛伏期結核的敏感性與特異性高達93.9%和90%[6],似乎區分價值很高，然而有報道[15]IP10區分活動性肺結核和健康人的敏感性和特異性為86%和94%，但區分潛伏期結核的敏感性和特異性為58%和61%，這些研究的設計方案均是對照為潛伏期結核或健康人群，似乎并沒有明顯的臨床癥狀。本研究設計是區分活動性肺結核和潛伏期結核合并肺炎，目的是對結核病原學陰性肺炎進行早期診斷和治療。Th17細胞的主要機制是分泌的IL-17細胞因子誘導TNFα、IL-6等促炎分子及炎癥細胞聚集與浸潤，導致機體免疫炎癥反應，在結核分枝桿菌感染的早期，IL17有助于肉芽腫的形成和病原體的清除，在疾病進展期失調的IL17高炎癥導致組織破壞，其后下調[16]。多數研究表明，與潛伏期結核相比，Th17細胞在活動性肺結核中的表達降低[10,17]，同時Th17細胞是明顯富集在潛伏期結核的細胞之一[18]。雖然這些研究對照沒有選擇潛伏期結核合并肺炎，但結果提示Th17細胞有可能是潛在的區分活動性結核和潛伏期結核合并肺炎的生物指標。本研究Th17細胞比例在活動性肺結核明顯下降，但在LITB+肺炎與LITB-肺炎之間無統計學意義，Treg細胞在3組之間均沒有差異，與Shu[19]報道的Treg細胞在活動性結核上調不一致，可能的原因是選擇對照為LITB+肺炎而非單純的LITB有關。不同的病原體感染會引起不一樣的免疫反應，這也可能會是引起結果不一致的原因，Min[20]等報道恒河猴感染結核分枝桿菌后血清IFN-γ在第6周達到峰值，在12周時恢復到基線水平，證實了以上的觀點。同樣的原因也體現在本研究血清CRP指標方面，系統評價[21]表明血清CRP區分活動性肺結核和非結核性肺炎的敏感性和特異性為89%和57%，該評價活動性肺結核納入標準為經培養病原學確診結核，肺結核感染肺炎并不期清楚是后合并潛伏期結核，與本研究設計方案和納入標準不一致,因此進一步設計研究方案探討是很有必要的。

研究表明INF-γ和MMP-1在活動性肺結核組明顯升高，MMP-9明顯下降，骨膜素沒有明顯變化，ROC曲線并沒有找到高敏感性和特異性的最佳診斷點，采用了多指標分類樹的方法區分活動性肺結核和非結核肺炎[22]。本研究首先采用Th17/CD4+和Th17/Treg區分活動性肺結核和非結核肺炎的ROC曲線下面積為：AUC=0.7485與AUC=0.6796，結果表明診斷價值并不高。雖然IGRAs不能區分活動性肺結核和潛伏期結核[13]，但IGRAs診斷活動性肺結核的敏感性較高，與Kang[23]報道一致。因此本研究先用IGRAs試驗將患者分為IGRAs陰性和IGRAs陽性，IGRAs陽性患者采用Th17/CD4+區分活動性肺結核和LTBI+pne，ROC曲線下面積為：AUC=0.8287，當Th17/CD4+<1.060為cut-off值時，診斷靈敏度為51.22%，特異性達到95.23%，誤診率為4.76%,雖然特異性很高，但敏感性較差，若以診斷活動性肺結核靈敏度大于85%為標準，ROC曲線顯示Th17/CD4+的cut-off值為小于2.10，其診斷活動性肺結核靈敏度為85.37%，特異性為57.14%，特異性顯得較低，因此建議當高度懷疑肺結核時，可采用高靈敏度的cut-off值，防止漏診，反之當臨床需排除肺結核時，可采用高特異性的cut-off值，防止誤診。表明用外周血Th17/CD4+區分活動性肺結核和LTBI+肺炎有一定的臨床診斷價值。

本研究有以下幾點創新，首先，本研究課題設計更適合臨床鑒別診斷，使肺炎患者盡早接受治療。其次，提出該診斷方案是先用IGRAs將患者分為IGRAs陰性和IGRAs陽性，IGRAs陰性按照非潛伏期結核肺炎治療，IGRAs陽性患者采用外周血Th17/CD4+指標根據臨床需求區分活動性肺結核和LTBI+pne，為臨床的診斷和治療提供幫助。本研究存在以下幾點局限性，首先，本研究納入樣本量偏小，因此統計學95%CI顯得更寬；其次，由于潛伏期結核的診斷尚無統一的標準，本研究潛伏期定義需要IGRAs試驗陽性，這樣會導致某些真實為潛伏期結核合并肺炎病例因IGRAs假陰性而排除在外；第三，本研究未納入小于16歲兒童，故本研究對兒童肺結核的診斷需要謹慎；第四，有報道[24]肺外活動性結核IGRAs假陰性率差異很大，故本研究只納入了肺結核患者，對肺外活動性結核的診斷尚需要進一步研究和評估。