長鏈非編碼RNA FOXD3-AS1在急性髓系白血病中的表達(dá)及功能

魯 猛，劉香來，王 芳，趙耀順

(1.廊坊市中醫(yī)醫(yī)院 內(nèi)科,河北 廊坊065000;2.華北石油管理局總醫(yī)院 血液內(nèi)科)

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)為惡性腫瘤性疾病，患者造血功能受到抑制，隨著醫(yī)療技術(shù)進(jìn)步，目前臨床上AML治療效果已明顯改善，但5年存活率仍然很低，嚴(yán)重威脅人類生命安全[1-2]。因此，研究AML發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對AML診療有重要意義。長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)節(jié)因子，涉及到細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、核轉(zhuǎn)運等多種過程[3]。越來越多的證據(jù)表明，LncRNA在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，成為新的生物標(biāo)記物和治療靶點[4]。LncRNA FOXD3-AS1是LncRNA的一種，研究發(fā)現(xiàn)LncRNA FOXD3-AS1在結(jié)直腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和患者預(yù)后有關(guān)[5]。研究表明，LncRNA FOXD3-AS1在非小細(xì)胞肺癌組織中上調(diào)表達(dá)，體外實驗表明，過表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲，LncRNA FOXD3-AS1通過靶向miR-127-3p/MED28軸調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展[6]。但是LncRNA FOXD3-AS1在急性髓系白血病中的確切作用機(jī)制尚不明確。本研究探討LncRNA FOXD3-AS1與急性髓系白血病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期為尋找AML新的診斷治療靶點提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者或家屬知情同意。選擇2015年1月～2017年6月血液科收治的AML(非M3型)患者73例。其中男性40例，女性33，年齡為27-68歲，中位年齡為51歲。根據(jù)WHO分型，其中M1、M2型患者37例，M4、M5型患者36例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《血液病療效及診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]關(guān)于AML的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)骨髓形態(tài)細(xì)胞學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)檢查；(2)患者首次診斷為AML；(3)臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)心、肝、腎等功能不全者；(3)接受過治療的AML患者；(3)不能按時隨訪者；(4)臨床資料不全者。

另選擇同期健康志愿者75例作為對照組，男性39例，女性36例，年齡為28～70歲，中位年齡為52歲。

1.2 主要材料與試劑

人急性髓系白血病細(xì)胞Kasumi-1購自中科院上海細(xì)胞庫，總RNA提取試劑盒購自Solarbio，人外周血淋巴細(xì)胞分離液(FICOLL配制)購自天津灝洋，Real-Time PCR試劑盒及SYBR Green PCR Kit購自日本Takara公司，LncRNA FOXD3-AS1及內(nèi)參GADPH的引物序列購自南京金斯瑞生物科技公司。干擾LncRNA RNA FOXD3-AS1表達(dá)質(zhì)粒(si-FOXD3-AS1)及對照質(zhì)粒(si-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC試劑盒購自索萊寶科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1標(biāo)本采集

采集AML患者及對照組人員骨髓2～3 ml，加Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心得到PBMCs，凍存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫琿RT-PCR法檢測LncRNA FOXD3-AS1的表達(dá)。

1.3.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

將Kasumi-1細(xì)胞按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Control組、si-NC組和si-FOXD3-AS1組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，按照Lipofectamine 2000說明書將si-NC和si-FOXD3-AS1分別轉(zhuǎn)染Kasumi-1細(xì)胞，Control組不做轉(zhuǎn)染處理，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.3 qRT-PCR法檢測LncRNA RNA FOXD3-AS1的表達(dá)

TRIZOL法提取PBMCs總RNA，定量分析后取2 μg RNA合成為cDNA置于-20℃保存。根據(jù)試劑盒說明書在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，其中LncRNA RNA FOXD3-AS1正向引物序列(5′→3′)：GGTGGAGGAGGCGAGGATG，反向引物序列(5′→3′)AGCGGACAGACAGGGATTGG；GADPH正向引物序列(5′→3′)：GGTGAAGGTCGGAGTCAACG，反向引物序列(5′→3′)：CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG，反應(yīng)結(jié)束后，以GADPH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算LncRNA FOXD3-AS1相對表達(dá)水平。

1.3.4MTT法檢測細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的各組Kasumi-1細(xì)胞接種于96孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h時，使用MTT試劑盒檢測細(xì)胞增殖，在490 nm酶標(biāo)儀檢測OD值，繪制生長曲線。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡

收集轉(zhuǎn)染后的各組Kasumi-1細(xì)胞，PBS洗滌后，加入70%乙醇在4℃條件下固定過夜，加入PI溶液，37℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。另取各組Kasumi-1細(xì)胞，使用Annexin V-FITC試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.6Transwell小室檢測細(xì)胞遷移與侵襲

侵襲實驗采用Matrigel膠包被Transwell小室上室，遷移實驗不包被，用無血清培養(yǎng)基稀釋各組轉(zhuǎn)染Kasumi-1細(xì)胞，加入Transwell上室，下室加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)取5個視野觀察，計算遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組觀察對象PBMCs中LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)水平

AML組患者PBMCs中LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組觀察對象PBMCs中LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)水平

2.2 LncRNA FOXD3-AS1在AML患者PBMCs中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

通過ROC曲線分析確定LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)水平的最佳截斷值為1.35，見圖1。以此截斷值為界，將AML患者分為高表達(dá)組(≥1.35)48例，低表達(dá)組(<1.45)25例。由分析結(jié)果可知，LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)水平與年齡、性別、分型無關(guān)(P>0.05)，與AML患者危險度分層、WBC水平、Hb水平、PLT水平有關(guān)(P<0.05)，見表2。

圖1 LncRNA FOXD3-AS1診斷AML的ROC曲線分析

表2 LncRNA FOXD3-AS1在AML患者PBMCs中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 [n/(%)]

2.3 LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)與AML患者3年總生存率的關(guān)系

LncRNA FOXD3-AS1高表達(dá)組AML患者3年存活率顯著低于低表達(dá)組(48.41% vs 68.55%，χ2=5.020，P<0.05)，見圖2。

圖2 LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)水平與AML患者預(yù)后關(guān)系

2.4 LncRNA FOXD3-AS1對Kasumi-1細(xì)胞增殖與凋亡的影響

與si-NC組比較，si-FOXD3-AS1組細(xì)胞增殖活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，表明抑制LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，見圖3、4與表3。

注：與si-NC比較，*P<0.05

圖4 各組細(xì)胞凋亡

表3 LncRNA FOXD3-AS1對Kasumi-1細(xì)胞凋亡的影響

2.5 LncRNA FOXD3-AS1對Kasumi-1細(xì)胞周期的影響

與si-NC組比較，si-FOXD3-AS1組G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期及G2/M期細(xì)胞比例顯著下降(P<0.05)，表明抑制LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)可將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，通過調(diào)控細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖，見表4。

表4 LncRNA FOXD3-AS1對Kasumi-1細(xì)胞周期的影響

2.6 LncRNA FOXD3-AS1對Kasumi-1細(xì)胞遷移與侵襲的影響

與si-NC組比較，si-FOXD3-AS1組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著下降(P<0.05)，表明抑制LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞遷移與侵襲，見圖5與表5。

圖5 各組細(xì)胞遷移與侵襲

表5 LncRNA FOXD3-AS1對Kasumi-1細(xì)胞遷移與侵襲的影響

3 討論

AML患者骨髓正常造血功能異常，以骨髓與外周血中原始和幼稚髓性細(xì)胞異常增生為主要特征，主要表現(xiàn)為貧血、出血、感染、全身發(fā)熱等癥狀，部分嚴(yán)重患者可發(fā)生肝、脾、淋巴結(jié)等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移浸潤，導(dǎo)致患者病情急重，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差[8-10]，該病的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。隨著對LncRNA功能不斷研究，LncRNA與疾病的關(guān)系逐漸受到關(guān)注[11]。LncRNA異常表達(dá)具有促癌或抑癌作用，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，越來越多研究顯示LncRNA在AML發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮非常重要作用，與疾病的復(fù)發(fā)、腫瘤的轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān)[12-13]。經(jīng)多項研究證實，多種LncRNA與血液系統(tǒng)惡性腫瘤相關(guān)，如LncRNA XIST、LncRNA LINP1、LncRNA KCNQ1OT1等在AML中異常表達(dá)，與患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)[14-15]。LncRNA FOXD3-AS1是LncRNA其中一種，位于FOXD3啟動子上游染色體1p31.3處，為啟動子上游的轉(zhuǎn)錄物。大量研究表明LncRNA FOXD3-AS1可影響多種人類腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等多種功能，與結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16-17]。有研究[18]表明，LncRNA FOXD3-AS1在多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者血清中明顯上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)與臨床分期、骨病分級和患者預(yù)后有關(guān)，是影響患者生存的獨立危險因素，提示LncRNA FOXD3-AS1在多種腫瘤中發(fā)揮致癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，LncRNA FOXD3-AS1在AML患者骨髓PBMCs中高表達(dá)，明顯高于健康對照組，與前人研究結(jié)果一致[18]。AML患者常伴有外周血Hb、PLT減少癥，WBC含量異常增高等嚴(yán)重并發(fā)癥，本研究分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)水平與AML患者危險度分層、WBC水平、Hb水平、PLT水平有關(guān)。進(jìn)一步通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA FOXD3-AS1高表達(dá)組AML患者3年存活率顯著低于低表達(dá)組患者存活率，表明LncRNA FOXD3-AS1高表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)。

研究顯示，LncRNA FOXD3-AS1在乳腺癌中呈高表達(dá)，抑制LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞系增殖、遷移與侵襲[17]。在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中，抑制LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)通過靶向調(diào)節(jié)miR-135a-5p表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞的增殖并同時，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。為研究LncRNA FOXD3-AS1在AML中的功能，本研究將si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染至Kasumi-1細(xì)胞，結(jié)果顯示，抑制LncRNA FOXD3-AS1可Kasumi-1細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

顯著抑制Kasumi-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，推測LncRNA FOXD3-AS1在AML中也發(fā)揮致癌作用，其表達(dá)水平升高可促進(jìn)AML的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，LncRNA FOXD3-AS1在AML患者骨髓PBMCs中高表達(dá)，與患者危險度分層等病理特征及不良預(yù)后有關(guān)，抑制LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)可顯著抑制AML細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，LncRNA FOXD3-AS1可能成為AML靶向治療的標(biāo)志物。然而在臨床治療中對LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)的影響未進(jìn)行深入分析，還有待進(jìn)一步從多角度開展多中心、大樣本研究。