小分子干擾RNA抑制鼻黏膜上皮細胞血管緊張素轉換酶2的表達

鮑羿岐，劉 洋，崔 娜，朱學偉

(吉林大學中日聯誼醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春130033)

血管緊張素轉化酶2(ACE2)是一種人體內參與血壓調節的蛋白，在肺、心臟、腎臟和腸道廣泛存在，ACE2表達于人鼻黏膜上皮細胞(HNECs)以及下呼吸道黏膜上皮細胞[1]。能否通過小干擾RNA(siRNA)技術沉默ACE2在鼻黏膜上皮細胞的表達，進而降低人對呼吸道病毒的易感性是一個非常有意義的科學方向。目前，ACE2表達變化對平滑肌細胞血管緊張素Ⅱ1型受體(AT-1 receptor)蛋白表達、細胞外信號調節激酶1/2蛋白(ERK1/2)、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)蛋白磷酸化水平的影響已經有相關報道[2]。本研究擬通過構建siRNA沉默呼吸道病毒刺突糖蛋白受體ACE2重組質粒，進一步觀察其對HNECs中ACE2的表達下調作用，以及其對p-ERK1/2、p-STAT3蛋白的磷酸化水平表達的影響，為以ACE2為靶點干預呼吸道病毒感染上呼吸道黏膜上皮奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人鼻黏膜上皮細胞株購自吉林省晨裕巴適得生物科技有限公司，呼吸道上皮培養基BEGM-F12為美國Lonza公司。小牛血清細胞培養液為Roche公司產品。RNA提取試劑盒為TRIzol reagent(美國Invitrogen)產品。逆轉錄試劑盒為SuperScript○RⅢ reverse transcriptase(美國Invitrogen)。兔抗人ACE2、ERK1/2、STAT3、p-ERK1/2、p-STAT3,GAPDH等蛋白抗體購自于英國Abcam公司。轉染試劑為美國Invitrogen的脂質體2000(Lipofectamine 2000)。

1.2 方法

1.2.1構建si-ACE質粒及細胞培養 構建血管緊張素酶2的小干擾RNA(ACE2siRNA)重組質粒：根據ACE2基因序列設計靶點特異性的ACE2小干擾寡核苷酸,起始于1205位點，連接到經BamHⅠ-Hind Ⅲ 酶切線性化的pSlincer3.1/H1質粒上制備待轉染的重組質粒。再將ACE2siRNA重組質粒與lipo2000脂質體混合均勻，孵育20 min。實驗分為3組：空白組，脂質體組(僅加入lipo2000脂質體)及si-ACE2(將上述混合液轉染人鼻黏膜上皮細胞，siACE2終濃度為500 ng/mL)。各組細胞培養72 h。

1.2.2RT-PCR檢測各組HNECs中ACE2 mRNA的表達 將上述各組細胞培養72 h后，提取鼻黏膜上皮細胞的總RNA，取每組細胞總RNA500 ng用于逆轉錄。基因擴增的引物如下。內參造物采用GAPDH。RT-PCR擴增反應體系為20 μl，其中RNA模板2 μg加入引物及去離子水使最終體積為20 μl。RT-PCR循環條件如下：37℃，15 min，50℃，5 min，然后在98℃下5 min，最后保持在4℃。然后，然后將PCR產物稀釋6倍并儲存在-20℃的冰箱，進行瓊脂糖凝膠電泳。引物:ACE2(Fw) 5’-CTCTACAGAAGCTGGACAGAAAC-3’,ACE2(Rev)5’-GAGCAGTGGCCTTACATTCA-3’,GAPDH(Fw) 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，GA-PDH(Rev) 5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。

1.2.3Western blot檢測各組中ACE2及ERK1/2,STAT3,p-ERK1/2,p-STAT3蛋白表達情況 上述各組細胞培養72 h后，將細胞裂解，并提取細胞裂解液蛋白，進行聚丙烯凝膠電泳。加入兔抗人ACE2(1∶500)及兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3(1∶1 000)，孵育過夜，洗脫，再加入二抗采用辣根過氧化物標記的鼠p-STAT3抗兔IgG(1：10000)。轉膜，成像(美國Bio Spectrum-UVP凝膠成像系統)，結果灰度分析采用ImageJ軟件進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據的統計分析。計量資料以均數±標準差表示，計數資料用率表示。采用卡方檢驗比較各組間率的差異。兩組均數間的比較采用t檢驗。相關性分析采用Pearson方法進行。所有的統計檢驗均采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測各組ACE2 mRNA的表達水平

各組細胞培養72 h后RT-PCR檢測ACE2的mRNA表達水平發現，各組都有ACE2 mRNA的表達。但si-ACE2組細胞中的ACE2的mRNA水平明顯低于空白對照組和脂質體組(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組中ACE2的mRNA及蛋白的表達

2.2 Western blot 檢測各組的ACE2蛋白表達及ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3蛋白及磷酸化水平

各組細胞培養72 h后，行Western blot檢測各組ACE2蛋白表達水平。檢測各組的ERK1/2和STAT3蛋白表達及磷酸化水平，發現si-ACE組ERK1/2和STAT3蛋白都明顯降低，p-ERK1/2、p-STAT3蛋白磷酸化水平卻顯著高于其他各組，結果具有統計學意義(P<0.05)，如表1及圖2所示。

表1 各組鼻黏膜上皮細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3及p-STAT3蛋白表達水平

圖2 各組鼻黏膜上皮細胞中p-ERK1/2、p-STAT3蛋白表達水平

3 討論

有研究通過電鏡顯示了病毒刺突糖蛋白受體結合結構域(RBD)與ACE2全長蛋白的復合物空間結構，揭示其可能互為受體[3]。ACE2是腎素-血管緊張素系統(RAS)血管保護軸的關鍵成員，調節心血管功能并在心血管疾病中發揮有益作用。有研究發現呼吸道病毒的刺突糖蛋白以三聚體形態存在，每一個單體中約有1 300多個氨基酸，其中300多個氨基酸構成了RBD，即病毒刺突糖蛋白與ACE2相連接的地方[4]。許多呼吸道病毒刺突糖蛋白的RBD的序列非常接近，相似性達到82%[5]。

鼻黏膜是呼吸道的門戶，也是病毒侵入機體的首要步驟。相關研究發現，鼻黏膜組織、支氣管活檢樣品、鼻甲和肺組織進行單細胞RNA-Seq測序，細胞角蛋白8(KRT8)在鼻黏膜上皮組織，支氣管活檢樣品、鼻甲和肺組織的細胞中廣泛表達。將KRT8作為表面細胞的標記，并表達ACE2、KRT8，和兩者都表達的細胞分別進行統計，發現在鼻刷黏膜上皮組織和鼻甲樣品中約有3.2%和2.1%的細胞共表達KRT8和ACE2[6]。進而，分別對7名患者通過PCR檢測其鼻和咽拭子中呼吸道病毒滴度，并通過循環閾值(CT)測量。研究發現W1，Z1及Z2 3名患者在其鼻拭子中檢測到了相關病毒，但在其咽拭子中未檢測到。在Z4患者中，鼻拭子和咽拭子中均檢測到病毒。此外，CT值比較結果表明鼻拭子中的病毒滴度高于咽拭子[7]。所以，下調鼻黏膜上皮ACE2的表達可能是降低易感性的一個重要手段。

通過靶向敲除技術抑制ACE2的表達已經有相關的科學探索[8]。研究結果顯示，ACE2的表達能夠降低MI誘導的細胞凋亡、巨噬細胞浸潤，同時ACE2基因敲除能夠促進HMGB1和促炎細胞因子的表達(TNF-α和IL-6)[9]。通過將含有ACE2基因的質粒DNA及si-ACE2用脂質體法轉染到各組SD大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(VSMC)中，Western-blot檢測發現si-ACE2組ACE2蛋白表達量明顯降低，同時P-ERK1/2、P-STAT3蛋白磷酸化水平明顯提高。ERK是extracellular regulated protein kinases的英文縮寫，指細胞外調節蛋白激酶，包括ERK1和ERK2，在介導細胞分化、增殖、存活中起重要作用，可被多種信號證實ACE2siRNA能抑制ACE2基因轉染的SD大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞ACE2蛋白的表達，ACE2蛋白表達的減少能上調AT1受體蛋白表達，同時提高其下游信號通路ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平[10]。

本研究中發現，通過小核酸干擾技術可以下調鼻黏膜上皮細胞ACE2的表達進而激活ERK1/2信號通路。激活P-ERK1/2、P-STAT3是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵[11]。鼻黏膜上皮細胞是呼吸道病毒感染人體的關鍵靶細胞。既往研究中證實HMGB1是鼻部炎癥中重要的因子，它參與呼吸道病毒的感染應答[12]。總之，本研究發現，起始于1205位點的小核酸對ACE2在基因水平有明顯的抑制效應。通過ACE2小核酸干擾不但能夠減少鼻黏膜ACE2表達，同時可能進一步活化ERK1/2 以及STAT3細胞信號通路，誘導下游 C-fos等信號的強化，抗炎功能受到抑制，但這些信號的釋放也可能是激活鼻黏膜局部防御性免疫應答的一部分。目前對于如何控制病毒在呼吸道傳播仍處于研究階段。本研究通過si-ACE2干擾鼻黏膜對ACE2的表達，以期可以達到控制、干預呼吸道病毒的復制及向呼吸道播散的目的，為干預病毒的傳播提供新的可能。