細胞外組蛋白在小鼠放射性心臟損傷中的意義

劉立杰，閆佳旭，白立立，張小陸，霍新龍，于曉麟，顧 濤，張 雙，賈洪菊，華海俠

(秦皇島市第一醫院，河北 秦皇島066000)

胸部惡性腫瘤發病率逐年升高，放射治療是胸部惡性腫瘤的主要治療手段之一。雖然放射治療技術在逐漸改進，但仍避免不了心臟及鄰近器官受到照射[1-2]。研究發現，放射性心臟損傷(RIHD)是非癌癥相關死亡率的主要原因之一[3]。RIHD可以降低心肌收縮和舒張功能，最終導致心肌電生理障礙、心律失常、心力衰竭甚至猝死[4-6]。目前RIHD病因機制尚不明確，但越來越多證據說明放療中、放療后會存在急性炎癥反應，受損的內皮細胞分泌黏附分子和生長因子，繼而促進腫瘤壞死因子(TNF)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6) 的分泌，促進炎癥反應和心肌纖維化[7-9]。因此如能針對性的進行抗炎治療，可能是預防甚至逆轉RIHD的有效措施[10]。細胞外組蛋白是一種促炎介質，在啟動和加重炎性損傷中起重要作用。本研究通過建立RIHD小鼠模型，外源性給予肝素進行干預，觀察其對RIHD是否有保護作用，并分析其作用機制與細胞外組蛋白的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物及分組 將60只雄性C57BL/6小鼠隨機分為3組：對照組、單純放射組、肝素聯合放射組，每組照射前、1 w、2 w、4 w、8 w 5個時間點各4只小鼠用于試驗。

1.1.2主要儀器及試劑 Trilogy H295795直線加速器、電熱恒溫鼓風干燥箱DGG-1940A型、SpectraMax 190全波長酶標儀、Biofuge Stratos全能臺式高速冷凍離心機、0.9%生理鹽水、PBS緩沖液、HE染色試劑、二甲苯、福爾馬林溶液、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、石蠟、蘇木素、鹽酸酒精、伊紅、中性樹膠等、Masson三色染色試劑盒、MPO ELISA試劑盒、細胞外組蛋白ELISA測定試劑盒、Luminex檢測系列細胞因子試劑盒、肝素鈉注射液。

1.2 方法

1.2.1實施方法 對照組只麻醉不放射；單純放射組、肝素聯合放射組分別給予6 MV-X線20Gy單次照射小鼠心臟；肝素聯合放射組在放射后每周同時間給予皮下注射肝素300 U/kg進行干預； 對照組與單純放射組每周同時間點給予腹腔內注射等體積質量分數為0.9%的氯化鈉溶液。分別于放射后0、1、2、4、8周摘小鼠眼球取血，并取小鼠心臟組織進行檢測，觀察病理變化、血清心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)水平、心肌組織髓過氧化物酶(MPO)水平、血漿細胞外組蛋白水平，轉化生長因子-β1(TGF-β1)以及血漿炎癥因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的動態變化。

1.2.2病理學觀察 采用蘇木精-伊紅(HE)染色法、Masson染色法觀察心臟病理損傷，并通過Masson染色定量測量心肌膠原容積分數(CVF)：CVF=視野中膠原纖維面積/視野總面積，求平均值進行定量分析。

1.2.3血清cTnI、CK-MB檢測 檢測前將凍存血漿復融，輕緩充分混勻，2 000 r/min離心15 min后取上清液，嚴格按試劑盒使用說明書操作。

1.2.4心臟組織標志物檢測 取凍存心臟組織嚴格按MPO試劑盒說明書步驟操作監測MPO水平。

1.2.5血漿細胞外組蛋白及細胞因子檢測 取凍存小鼠血漿嚴格按試劑盒說明書步驟操作。用ELISA法檢測小鼠血漿細胞外組蛋白水平，應用液相芯片分析系統(Luminex法)檢測小鼠TGF-β1、血漿炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平的動態變化。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠造模及干預后HE染色心肌組織病理變化

HE染色放射后單純放射組、肝素聯合放射組小鼠1、2周心肌病理變化不顯著,放射后4、8周后心臟間質中可見中性粒細胞、淋巴細胞數量增多，心肌細胞排列略微散亂，間質增寬。其中肝素聯合放射組小鼠較單純放射組心臟損傷的病理改變明顯好轉，炎細胞浸潤減輕，但仍較對照組小鼠高，見圖1。

圖1 各組小鼠HE染色顯微鏡檢結果(×200)

2.2 各組小鼠放射損傷干預后Masson染色心肌組織病理變化

Masson染色放射后單純放射組、肝素聯合放射組小鼠1、2周心肌病理變化不著，放射后4、8周可見心肌細胞排列紊亂，心肌細胞間質、血管周圍藍染的膠原纖維沉積較對照組明顯增多，其中肝素聯合放射組小鼠上述病理改變明顯好轉，膠原纖維沉積減少，纖維化程度減弱，但仍較對照組小鼠變化顯著，見圖2。

圖2 各組小鼠Masson染色顯微鏡檢結果

2.3 各組小鼠放射損傷干預后心肌膠原容積分數(CVF)評估

定量分析各組小鼠心肌膠原容積分數(CVF)，各組小鼠CVF在放射后1、2周時無明顯變化，P>0.05。

單純放射組及肝素聯合放射組放射后4周時達到最大值分別為(11.05%±0.16% vs 7.21%±0.17%)，4周后兩組CVF水平減少，但仍高于對照組(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組小鼠不同時間心肌膠原容積分數(CVF)變化情況

2.4 各組小鼠放射損傷干預后血清標志物水平

單純放射組及肝素聯合放射組的cTnI在放射后2周達到最高分別為(500.51±0.78 vs 285.89±0.85)，2周后水平開始下降，肝素聯合放射組的cTnI測得值較相應時間單純放射組降低，仍高于對照組(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組小鼠不同時間cTnI水平變化情況

單純放射組及肝素聯合放射組的CK-MB在放射后1周達到最高分別為(649.12±1.16 vs 289.56±1.66),1周后水平開始下降，肝素聯合放射組的CK-MB測得值較相應時間單純放射組降低，但仍高于對照組(P<0.05)，見圖5。

圖5 各組小鼠不同時間CK-MB水平變化情況

2.5 各組小鼠放射損傷干預后血漿細胞外組蛋白水平的動態變化

單純放射組及肝素聯合放射組的細胞外組蛋白水平在放射后2周達到最大分別為(0.86±0.23 vs 1.64±0.67)2周后開始下降，肝素聯合放射組的測得值較相應時間單純放射組降低但仍高于對照組(P<0.05)，見圖6。

圖6 各組小鼠不同時間血漿細胞外組蛋白水平變化情況

2.6 各組小鼠放射損傷干預后組織勻漿液MPO水平的動態變化

單純放射組及肝素聯合放射組的組織勻漿液MPO水平在放射后1周達到最大,1周后開始下降，肝素聯合放射組的測得值較相應時間單純放射組降低，仍高于對照組(P<0.05)，見圖7。

圖7 各組小鼠不同時間MPO水平變化情況

2.7 各組小鼠放射損傷干預后血漿TGF-β1水平的動態變化

單純放射組及肝素聯合放射組的血漿TGF-β1水平在放射后4周達到最大,分別為(26.76±0.72 vs 22.67±0.13)，4周后開始下降，肝素聯合放射組的測得值較相應時間單純放射組降低，仍高于對照組(P<0.05)，見圖8。

圖8 各組小鼠不同時間血漿TGF-β1水平變化情況

2.8 各組小鼠放射損傷干預后血漿IL-1β、IL-6、TN F-α水平的動態變化

與單純放射組相比，肝素聯合放射組的血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平在各時間點水平均明顯下降，與對照組小鼠同時間點水平有明顯統計學差異(P<0.05)，見圖9-11。

圖9 各組小鼠不同時間血漿IL-1β水平變化情況

圖10 各組小鼠不同時間血漿IL-6水平變化情況

圖11 各組小鼠不同時間血漿TNF-α水平變化情況

3 討論

RIHD是胸部腫瘤放療中一種常見的并發癥[1，11]，可以導致心肌電生理障礙、心律失常、心力衰竭甚至猝死[4-6]，嚴重影響患者的生活質量。但是目前關于RIHD的發病機制尚未完全闡明。有研究表明，RIHD的發生是炎癥和纖維化途徑相互作用的結果[12]，其早期會出現炎癥反應，中性粒細胞被募集激活，釋放大量MPO、炎性細胞因子如TNF和白細胞介素(IL-1、IL-6和IL-8)，隨著照射次數的增加，巨噬細胞分泌轉化生長因子TGF-β，其負責成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，最終引起心肌纖維化，導致RIHD的發生。本研究中各組小鼠在照射前期(1、2周)后血清CK-MB、cTnI水平、組織勻漿液MPO水平、血漿炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平升高，照射后期(4周)后出現了典型的心臟損傷纖維化的病理學表現，同時血漿TGF-β1水平在放射后4周達到最大，其變化規律與心肌膠原容積分數CVF趨勢一致，說明TGF-β表達的升高促進了膠原合成和沉積，是形成RIHD晚期心肌纖維化的重要環節。證實了RIHD的發生是早期炎癥反應和晚期心肌纖維化相互作用的結果。因此抗炎治療、通過抗炎逆轉纖維化的藥物干預是RIHD預防甚至逆轉RIHD的有效措施[13-14]。

大量研究表明，細胞外組蛋白具有促炎作用，它作為損傷相關分子模式(DAMP) 分子的新成員，在激活免疫及炎癥反應，啟動或加重組織損傷等方面發揮重要作用。有多項研究已經探討了細胞外組蛋白在急性肝衰竭、急性缺血性腎損傷、放射性肺損傷、膿毒血癥等疾病中的作用[15-18]。這些研究均顯示，細胞外組蛋白能介導炎性損傷反應，參與多種疾病的發生發展。本研究結果顯示細胞外組蛋白和血清中cTnI、CK-MB、血漿炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)都在1周后開始升高，提示細胞外組蛋白可能在RIHD的早期啟動階段發揮促炎作用。因此探索中和或降解細胞外組蛋白的有效藥物是當前的研究熱點[19]。肝素是一種高度硫酸化的蛋白聚糖，是臨床常用的強效抗凝劑，但也有重要的抗炎作用[20]。溫韜等人[21]研究報道說明肝素能有效結合并降低血漿中的細胞外組蛋白水平。本課題組的前期研究也說明了細胞外組蛋白在肝癌射頻消融術后、放射性肺損傷中的作用，體外和體內模型中也研究了組蛋白誘導的細胞毒性和肝素的保護作用的基本機制[22-24]。本研究結果顯示與單純放射組相比，肝素聯合放射組小鼠心臟損傷的病理表現明顯好轉，炎細胞浸潤減少，膠原纖維沉積減弱，CVF下降，血清中cTnI、CK-MB、細胞外組蛋白水平、血漿炎癥因子測得值均明顯下降，其中細胞外組蛋白及炎癥因子水平在放射1、2周后下降更為明顯，推測肝素可能中和了細胞外組蛋白從而減輕了炎癥反應，對炎癥具有抑制作用。

總之，本次研究通過建立放射性心臟損傷小鼠模型，外源性給予肝素進行干預，分析肝素干預前后細胞外組蛋白水平變化，探索了其在小鼠放射性心臟損傷中的意義。