安琪生香活性干酵母對濃香型強化大曲微生物群落結構及其揮發性風味組分的影響

潘天全，關玉權，陳興杰，楊金玉，鞏子路，薛錫佳，李 娜，代 森，程 偉

（安徽金種子酒業股份有限公司，安徽阜陽 236023）

中國白酒以大曲作為釀造的糖化、發酵、酒化與生香劑，大曲的微生物結構及其風味特征是大曲質量評價的重要依據，大曲品質對白酒的產率和品質具有重要影響[1]。大曲微生物結構對大曲風味及其原酒的風格和品質具有重要影響[2]，研究大曲微生物結構及風味組分，對明確白酒風格特點具有重要意義。強化曲是采用微生物分離技術，篩選出能夠充分提高酒曲性能的有益菌種，進行人工純種培養，接種到酒曲中以強化其各項性能，從而進一步提高出酒質量[3]。純種工藝技術的發展使得小曲的糖化發酵力普遍強于大曲，強化曲是將自然接種和人工接種相結合[4]，提高酒曲的發酵性能。由于大曲的培養受自然界環境影響較大，導致大曲質量不穩定，因此，強化曲的研究主要集中在大曲強化方面。姚繼承等[5]在大曲培養中加入酯化紅曲霉，制備酯化率較高的強化大曲；馮雅芳等[6]將酵母菌、黑曲霉和紅曲霉混合加入大曲培養過程中，大曲的綜合指標得到了改善；陳雪玲等[7]在大曲中添加復合菌劑，大曲的糖化力、液化力、發酵力和酯化力等得到了顯著提高；顏林春[8]將篩選到的10 株功能芽孢桿菌經純種培養后加入到制曲原料中，制成的強化高溫大曲符合一級高溫大曲的質量控制指標。大曲的香氣是大曲感官質量的重要指標，由于大曲中含有較多的色素與油脂，不宜采用液液萃取的前處理方法進行香氣檢測。頂空固相微萃?。℉SSPME）作為大曲風味分析的前處理方法，可以有效減少底物及液態基質中干擾物質的影響。

當前，關于安琪生香活性干酵母作為強化菌劑培養強化大曲的應用研究還鮮有報道。本實驗以傳統的濃香型大曲工藝為基礎，應用安琪生香活性干酵母培養強化大曲，采用MiSeq 高通量測序技術進行大曲微生物群落結構分析，采用HS-SPMEGC-MS 聯用技術進行大曲揮發性風味組分分析，并進行成品曲的質量與感官對比。該研究有助于明確酵母強化大曲的微生物群落結構及其風味特征，為安琪生香活性干酵母等微生物制品的生產應用提供依據，并有利于強化大曲的培養工藝調整及質量調控。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗曲樣：濃香型普通大曲與強化大曲（培曲時間均為28 d，培曲月份為春季的4—5 月）；強化大曲應用安琪生香活性干酵母作為強化菌劑，在制曲壓坯的拌料階段添加。實驗曲樣由安徽金種子酒業股份有限公司生態釀酒基地制曲車間提供。

試劑耗材：2%濃度的瓊脂糖凝膠，膠回收試劑盒，qiagen公司。

儀器設備：氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS，7890A+5975C，EI 源），安捷倫科技有限公司；57330-U 手動SPME 進樣器，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭，美國Supelco 公司；恒溫磁力攪拌器85-2，常州普天儀器制造有限公司；TGL-20M 高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；GeneAmp@9700 型聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCPO 儀），美國ABI 公司；MX.S 型可調式混勻儀，美國SCILOGEX 公司；QuantiFluor 型-ST 藍色熒光定量系統，美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大曲培養及其取樣方法

大曲培養：（1）配制2.5 %的糖液，用量為安琪生香干酵母質量的20～30倍，調溫至35 ℃，將干酵母溶解于活化液中活化1 h 左右[9]；（2）強化大曲培養的工藝流程，原料選擇（小麥）→潤料破碎→加入活化后的生香活性干酵母（添加量為總投料量的0.5%）→加水攪拌→機械壓曲→入房臥曲→培菌掛衣→翻曲、通風排潮→攏堆、合房→品曲（感觀評價、理化分析）→出曲→入庫貯存；（3）普通大曲的培養及工藝流程均與強化大曲相同，普通大曲的曲料中不添加安琪生香活性干酵母等微生物制劑。

取樣方法：分別取成品曲的曲皮（區塊表面的1～2 cm）和曲心（曲塊中心的2～3 cm3）作為實驗樣品，在無菌環境下分別粉碎后保存于無菌袋中，置于-80 ℃冰箱備微生物分析；強化大曲的曲皮和曲心樣品分別表示為FDS 和FDI，普通大曲曲皮和曲心樣品分別表示為NDS 和NDI。在成品曲橫斷面的上表層、中層、內層等部位分別等量取樣，粉碎混合后置于-4 ℃冰箱備GC-MS 檢測及常規理化分析。

1.2.2 大曲樣品的微生物群落分析

采用CTAB 或SDS 方法提取實驗樣品的總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣本DNA 于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物(Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer: New England Biolabs)和高效高保真酶進行PCR擴增定量，確保擴增效率和準確性。

16S V4 區引物（515F 和806R）：鑒定細菌多樣性；18S V4區引物（528F和706R）：鑒定真核微生物多樣性；ITS1 區引物（ITS5-1737F 和ITS2-2043R）：鑒定真菌多樣性。PCR 產物使用2 %濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；對檢測合格的PCR產物進行磁珠純化，采用酶標定量，根據PCR 產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，對目的條帶使用qiagen 公司提供的膠回收試劑盒回收產物。

文庫構建和上機測試：使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit 和Q-PCR 定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000 進行上機測序。建庫與測序等工作在蘇州帕諾米克生物科技有限公司完成。

1.2.3 大曲樣品的HS-SPME-GC-MS分析

參考Ding 等[10]的方法，準確稱取1.00 g 大曲樣品放入頂空瓶中，加入20 μL 2-辛醇溶液（內標終濃度為55.04 μg/g），蓋上瓶蓋。取50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，在磁力攪拌器上插入加有20 μL 2-辛醇甲醇溶液和1.00 g 大曲的頂空瓶，萃取溫度60 ℃，平衡10 min后頂空吸附35 min，插入溫度為250 ℃的氣質聯用儀上解吸5 min 后進行檢測。

氣相色譜條件：氦氣作為載氣，流速控制為1 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃，維持3 min，以5 ℃/min 升至80 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，維持8 min；氣化室溫度為250 ℃；不分流。質譜條件：選擇電子轟擊電離離子源（EI），電子能為70 eV，離子源溫度為230 ℃，質量范圍控制在40～400 u。

采用質譜計算機自帶的NIST 數據庫定性，各香氣物質組分的質譜經計算機譜庫檢索，結合相關報道文獻解析譜圖，選擇匹配度＞50的鑒定結果以確定香氣物質種類，進行定性分析；以2-辛醇內標，通過將各香氣物質組分峰面積含量除以所有測得香氣物質峰面積含量綜合，與2-辛醇質量濃度作比進行計算，進行半定量分析。

式中，c：大曲中的揮發性風味物質的濃度；cis：大曲中內標的終濃度；Ac：大曲揮發性風味物質的峰面積；Ais：內標物質的峰面積。

1.2.4 大曲樣品的理化指標檢測與感官評價

水分含量：采用質量恒定法；酸度：采用酸堿中和法；糖化力：采用斐林試劑滴定法；酯化力：采用酸堿滴定法[11]。依據參考文獻對普通大曲和強化大曲進行感官評價[12]，并依據評分結果繪制雷達圖。

2 結果與分析

2.1 濃香型強化大曲的培養工藝分析

濃香型強化大曲以純小麥為主要原料，并添加一定比例的大麥、豌豆等，原料破碎后添加活化后的安琪生香活性干酵母（添加量為總投料量的0.5 %），拌和均勻后進行機械壓塊制曲、入房培菌及排潮管理。培曲過程中，每天兩次檢查房內溫度（室溫以房內自然溫度為準）并做好記錄，翻曲操作要求“上翻下，下翻上，里拿外，外拿里”等，并調整曲塊的行間距離。通過開關門窗等方式調整不同培曲階段的溫度和濕度，以利于制曲有益微生物的生長繁殖。前期排潮時，對流通風增氧，每天開門窗2～3 次；進入中挺階段后遵循“潮大多排、潮小少排、無潮不排”等原則[13]。排潮期間的排潮量一般要求為60 %～70 %，培曲前期房內相對濕度達到93 %～96 %，培曲中挺階段曲房內的相對濕度達到96 %～98 %，培曲后期曲房內相對濕度＜80 %。培曲前期溫度25～45 ℃，培曲中挺階段品溫達到50～60 ℃，培曲后期溫度45～50 ℃，最后進行出房入庫。

強化大曲應用安琪生香活性干酵母作為強化菌劑，在制曲壓坯的拌料階段添加。由圖1 可知，強化大曲和普通大曲的溫度變化規律基本都遵循“前緩、中挺、后緩落”的變化規律，但仍存在一定的差異。在大曲培養的0～4 d，曲房內氧濃度較大，酵母菌和霉菌等微生物快速繁殖，曲坯溫度升溫較快；在大曲培養的5～8 d 時曲坯達到頂溫，強化大曲的曲溫始終略高于普通大曲，可能是強化大曲在配料時添加了一定比例的安琪生香活性干酵母使得制曲微生物的種類和數量均有所增加，加快了大曲微生物的繁殖代謝。隨著培養的進行，強化大曲的品溫明顯高于普通大曲，而且頂溫的“中挺”時間較長，這可能與培曲前期強化大曲中制曲微生物的代謝旺盛導致淀粉和還原糖消耗的同時產生了大量水分等因素有關。

圖1 大曲培養過程中的室溫與品溫變化情況

2.2 強化大曲微生物群落結構的對比分析

分別對強化大曲和普通大曲的曲皮與曲心樣品提取總DNA 并進行測序，測序長度與設計引物擴增長度接近，表明本實驗的測序結果較合理?；贗llumina Nova 平臺測序構建PCR-free 文庫，通過對Reads 的拼接，再對各樣品測序序列進行質控過濾后得到有效序列，并進行聚類分析。對測序結果在97%相似度的OTU 水平進行Chao 指數計算，各樣品Coverage ≥0.999，表明本實驗的測序結果可以較為真實地反映各樣品中的細菌和真菌等微生物的多樣性，測序結果的有效性較高。Ace 指數是用于計算群落豐度的指數，其值越大說明樣品中微生物的豐度越高[14]。由表1可知，FDS和FDI的Ace指數在對應樣品組中均最高，表明FDS 和FDI 的微生物豐度可能高于其他曲樣。Chao1 指數能估算樣品中含有的物種數目，常用來估計物種總數[15]，由表1 可知，FDS 和FDI 的Chao1 指數在對應樣品組中均最高，表明FDS 和FDI 的物種總數可能高于其他曲樣。綜上表明，強化大曲（FDS、FDI）的微生物豐度和物種總數均高于普通大曲（PDS、PDI）。

表1 不同大曲樣品微生物的Illumian Mi Seq高通量測序結果及Alpha多樣性指數

由圖2（a）可知，不同樣品中豐度占比較高的真菌門主要包括子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）；FDS 中的子囊菌門（Ascomycota）占比為34.05 %，明顯低于NDS (91.85 %)；FDS 中的毛霉菌門（Mucoromycota）占比為64.00 %，明顯高于NDS(8.23 %)。在不同的曲心樣品中，NDI 中的子囊菌門（Ascomycota）占比為54.31 %，明顯低于FDI(95.54%)；NDI 中的毛霉菌門（Mucoromycota）占比為46.55%，明顯高于FDI(2.72%)。由圖2（c）可知，FDS 的優勢菌屬為根霉屬（Rhizopus，62.77 %），FDI 的優勢均屬為嗜熱子囊屬（Thermoascus，44.89 %）；扣囊復膜孢酵母菌屬（Saccharomycopsis）在NDI 中的占比為2.86 %，在FDS 中的占比達到17.10%，明顯高于NDI，這可能是由于添加酵母制品用于強化制曲所造成的。

由圖2（b）可知，不同樣品中豐度占比較高的細菌門主要包括厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）；NDS中厚壁菌門（Firmicutes）的占比為59.87 %，明顯低于FDS（60.81 %），NDI 中厚壁菌門（Firmicutes）的占比為91.90 %，明顯高于FDI（23.69 %）。值得注意的是，FDI 中的變形菌門（Proteobacteria）占比為23.69%，明顯高于NDI（2.05%）。如圖2（d）所示，FDS中的魏斯氏菌屬（Weissella）占比為31.84%，明顯高于NDS（19.06 %）；FDI 中泛菌屬（Pantoea）的占比為40.19 %，顯著高于NDI（0.91 %）；FDI 中糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）的占比為7.56 %，顯著高于NDI（1.23%）。

圖2 基于不同水平的濃香型大曲微生物相對豐度柱狀圖

綜上表明，強化大曲的微生物菌群結構明顯區別于普通大曲，添加酵母制品用于強化制曲對大曲的微生物多樣性具有顯著影響。強化大曲主要優勢真核微生物菌屬有根霉屬（Rhizopus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和扣囊復膜孢酵母菌屬（Saccharomycopsis），主要優勢原核微生物菌屬包括魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）和糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）。

2.3 強化大曲風味特征的對比分析

大曲在白酒發酵過程中不僅發揮著糖化發酵劑的作用，大曲自身的香氣對白酒發酵也有輔助增香的功能[16]。利用頂空固相微萃?。℉S-SPME）結合氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）從強化大曲和普通大曲中分別檢測到42 種和29 種揮發性風味組分，主要包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、含氮類、呋喃類和芳香族化合物。

由表2 可知，強化大曲揮發性風味組分數量最多的為酯類化合物，共有12 種，其次為含氮類和醛酮類化合物，均有7 種，強化大曲中還含有芳香族化合物6種，呋喃類化合物4種，含醇類化合物和酸類化合物均為3 種。普通大曲揮發性風味組分數量最多的為酯類化合物，共有12 種，其次為芳香族化合物6 種，含氮類化合物4 種，呋喃類、酸類和醛酮類化合物均為2 種，含醇類化合物1 種。強化大曲揮發性風味組分的數量高于普通大曲，醛酮類和含氮類化合物的數量差別明顯。為進一步對比強化大曲和普通大曲揮發性風味組分的含量差異，以2-辛醇內標，采用半定量的方法計算揮發性風味組分的含量。

表2 強化大曲和普通大曲揮發性風味組分的HS-SPME-GC-MS分析及其對比

由表3、表4 可知，強化大曲和普通大曲揮發性酯類化合物的種類數相同，但含量差異明顯，強化大曲中揮發性酯類化合物的總含量為171.5814 μg/g，普通大曲中揮發性酯類化合物的總含量為109.8328 μg/g，強化大曲中揮發性酯類化合物的總含量明顯高于普通大曲。酯類化合物通常呈現花香和水果香味，酯類化合物能通過醇類和脂肪酸的酯化反應生成，也可以由微生物發酵過程中的乙酰輔酶A 途徑生成。一般來說大曲中酯類的合成前期可能與乙酰輔酶A 途徑有關，而后期與酯化反應有關[17]。強化大曲中添加的生香活性干酵母可能會促進醇類和脂肪酸之間的酯化反應，或者是有利于促進大曲發酵過程中乙酰輔酶A 途徑的進行。強化大曲中揮發性醛酮類化合物的種類數明顯高于普通大曲，且強化大曲中揮發性醛酮類化合物的總含量為7.5096 μg/g，明顯高于普通大曲中揮發性醛酮類化合物總含量的4.8843 μg/g。醛類化合物可能是大曲微生物降解原料中的淀粉類物質在糖酵解過程中產生，醛類化合物常有杏仁、青草味，酮類化合物可能是由微生物參與的脂肪酸β-氧化途徑生成[16，18]。綜上表明，大曲培養過程中添加生香活性干酵母有助于大曲中酯類、醇類、酸類、醛酮類、含氮類、呋喃類和芳香族化合物等揮發性風味化合物的生成，對大曲的香氣起到積極的促進作用。

由表3、表4 可知，強化大曲中揮發性含氮類化合物的數量明顯高于普通大曲，強化大曲中揮發性含氮類化合物的總含量為3.8618 μg/g，普通大曲中揮發性含氮類化合物總含量為2.7338 μg/g。大曲中含氮化合物主要包括吡嗪、吡啶和噻唑等化合物，含氮化合物可以通過非酶促反應比如美拉德反應生成。在培養溫度超過50 ℃后大曲中耐高溫的芽孢桿菌逐漸變成優勢微生物，對含氮類化合物的生成具有積極的促進作用[19]。吡嗪類化合物通常呈現烘焙和堅果香味，該類化合物在大曲的焦香味等風味中起到積極作用。白酒中發現的含氮類化合物很可能是由大曲帶入白酒固態發酵體系中所造成的[20]。與普通大曲相比，培曲過程中強化大曲升溫快、升溫高且“中挺”保溫時間較長，有利于促進強化大曲中揮發性含氮化合物種類及含量的增加。

表3 采用HS-SPME-GC-MS對強化大曲進行揮發性風味組分檢測的分析鑒定結果

表4 采用HS-SPME-GC-MS對普通大曲進行揮發性風味組分檢測的分析鑒定結果

2.4 強化大曲感官評分及其質量特征的對比分析

2.4.1 強化大曲和普通大曲的理化指標分析

大曲的水分、酸度等理化指標在一定程度上能夠反映大曲的質量；大曲的糖化力、酯化力等指標反映了大曲酶系的功能組成及微生物的生長代謝情況，也可作為大曲質量評價的重要依據。由表5可知，強化大曲的水分含量、酸度、糖化力和普通大曲差別不明顯。強化大曲的酯化力和發酵力明顯高于普通大曲，可能是培曲前期強化大曲的升溫略高于普通大曲，強化大曲的“頂火”時間維持較長，且培曲后期緩慢落火。結合圖2 的大曲微生物分析表明，強化大曲中的酵母菌群豐富，有利于強化大曲的產酯產香，促使其曲香更加濃郁。

表5 強化大曲和普通大曲的理化指標檢測結果

2.4.2 強化大曲和普通大曲的感官評分標準及評分

普通大曲的感官品質可依據成品曲的外觀、斷面和香味等感官指標進行初步描述。本文對強化大曲和普通大曲的外觀、火圈及菌絲情況、曲心及窩潮情況、曲皮厚度以及曲香等五個方面進行感官評價評分。由表6 可知，在外觀、曲心及窩潮情況、曲皮厚度等方面，強化大曲和普通大曲的差別不明顯，均在9.3～9.5分；曲香方面，強化大曲評分為9.8分，高于普通大曲的9.5 分。結合理化分析結果表明，強化大曲的酯化力明顯高于普通大曲，可能是強化大曲中添加的生香活性干酵母對大曲發酵過程中的產酯產香起到積極促進作用，有利于增強強化大曲的曲香。

表6 強化大曲和普通大曲的感官評價評分(濃香型釀酒大曲的感官評價[12])

2.4.3 強化大曲和普通大曲的感官評價雷達圖分析

感官評價雷達圖具有數字化、直觀性等特點，廣泛應用于酒類、香精等食品或風味產品的感官質量評價及微生物發酵工藝優化等領域[21]。Englezos等[22]應用感官評價雷達圖研究了混合菌種酒精發酵對乳酸菌生長及蘋果酸-乳酸活性的影響；辛松林等[23]基于電子舌技術，采用雷達圖對中國白酒與雞尾酒基酒的比較作出感官評價；Lezaeta等[24]建立了以感官和消費感知為主導的香氣評價方法，對白葡萄酒的香氣進行研究。雷達圖的使用能更直觀、準確的分析不同大曲之間的感官差別及特點。

目前，感官評價雷達圖在釀酒大曲感官評價中的應用較少。本研究結合感官評價雷達圖分析對強化大曲與普通大曲的感官指標進行比較，以期直觀反映出強化大曲和普通大曲的感官差異。將大曲的感官描述分為外觀、火圈及菌絲情況、曲心及窩潮情況、曲皮厚度和曲香等五類，通過專業的評曲人員，對不同類別的大曲樣品進行感官評價，并以評分結果為依據繪制感官評價雷達圖。由圖3可知，在外觀、曲心及窩潮情況、曲皮厚度、火圈及菌絲情況等方面，強化大曲和普通大曲差別不明顯；在曲香方面，強化大曲明顯優于普通大曲，強化大曲的曲香更加濃郁。

圖3 強化大曲和普通大曲的感官評價雷達圖

3 結論

濃香型大曲通常采用小麥、豌豆等作為制曲原料，經粉碎潤水后壓制成磚塊狀曲坯，自然環境下接種環境微生物，經固態發酵培養成釀酒糖化發酵劑。大曲的質量關系到曲酒的品質，傳統制曲采用自然接種，不同發酵階段的微生物種類及數量不同[25]。大曲微生物多樣性研究對探究不同制曲工藝的微生物差異、解析相關功能菌株具有重要意義；功能菌株的篩選、純化及強化應用，對提高白酒品質、原料利用率和特征風味成分含量等具有重要影響，有利于為微生物菌群的強化應用提供思路。當前，強化大曲研究主要包括接種不同的有益菌株及其接種比例、制曲工藝優化等方面，常見的大曲強化菌種包括酵母菌、絲狀真菌和細菌等[26]。

本研究采用MiSeq 高通量測序技術分別解析強化大曲和普通大曲曲皮和曲心的微生物群落結構，應用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(HS-SPME-GC-MS)進行大曲揮發性風味組分分析，得到的結論有：（1）強化大曲的微生物群落結構明顯區別于普通大曲，強化大曲的主要優勢真核微生物菌屬有根霉屬（Rhizopus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和扣囊復膜孢酵母菌屬（Saccharomycopsis），主要優勢原核微生物菌屬有魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）和糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）；（2）強化大曲中揮發性風味組分的種類及酯類、醛酮類和含氮化合物的含量均高于普通大曲，強化大曲的曲香更加濃郁。本研究有助于明確酵母強化大曲的微生物群落結構及其風味特征，為安琪生香活性干酵母等微生物制品的生產應用提供依據，有利于強化大曲的培養工藝調整及質量調控。