基于測量不確定度評定啤酒中雙乙酰合格率的研究

郭 勝，閆俊鋒，楊 瑩，徐 程，李文慧，黃婷婷，介恬靜，龔 琛，朱桂生

（1.襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北襄陽 441000；2.榆林市食品檢驗檢測中心，陜西榆林 719000）

雙乙酰是酵母進行纈氨酸合成代謝過程中產生的中間產物（α-乙酰乳酸）積累并分泌到酵母細胞外，通過氧化脫羧反應而產生[1]，屬于啤酒發酵過程中產生的不良風味物質[2]。在啤酒中,雙乙酰的風味閾值為0.15 mg/L，飲用雙乙酰含量超標的啤酒時會有一種餿飯味，嚴重影響口感[3]。為保證啤酒的良好風味，雙乙酰已成為啤酒的常規檢測項目。

測量往往會產生測量不確定度[4-5]，啤酒中雙乙酰的測量也不例外。當存在測量不確定度時，真值在一定的置信概率下落在“測量值±測量不確定度”所構成的區間里[6]。當測量值處在容許限附時，真值可能落在限量值內，也可能超出限量值，這時測量值有一定的合格概率，測量結果的符合性判定存在一定的誤判概率[7]。CNAS-TRL-010：2019《測量不確定度在符合性判定中的應用》[8]給出了通過測量不確定度評定合格概率的理論以及詳細計算步驟。

啤酒國家標準GB/T 4927—2008《啤酒》[9]規定啤酒中雙乙酰的檢驗方法為GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[10]，GB/T 4928—2008[10]中雙乙酰的檢驗采用紫外分光光度法。紫外分光光度法定量分析的常規方法是先繪制標準曲線，將樣品吸光值帶入標準曲線得到樣品濃度。GB/T 4928—2008[10]中雙乙酰的測定方法并沒有繪制標準曲線，而是直接測定樣品吸光值求得的雙乙酰含量，在這種情況下如何計算紫外分光光度計引入的不確定度是當前需要解決的問題。目前針對這類測量不確定度評定的研究很少，本次測量不確定度評定對單次測量吸光度得到測量結果的檢驗具有一定的參考意義。在測量不確定度評定之后，本研究基于測量不確定度計算了啤酒中雙乙酰含量的合格概率，并給出了計算指定合格概率下，啤酒中雙乙酰的控制方法。本研究對啤酒生產企業控制雙乙酰含量具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：啤酒（一級），市售。

試劑：鹽酸（分析純），西隴科學股份有限公司；鄰苯二胺（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司。

儀器設備：紫外可見分光光度計（UV2550），日本島津公司；AG135 電子天平（Max=101 g，d=0.1 mg），METTLER TOLEDO Made in Switzerland。

1.2 實驗方法

1.2.1 啤酒中雙乙酰的測定方法[10]

安裝好雙乙酰蒸餾器，將蒸氣發生瓶加熱至沸騰。通氣預熱，將25 mL 容量瓶置于冷凝器出口收集餾出液。在100 mL量筒中加入1滴消泡劑，加入未經除氣、冷卻至5 ℃的啤酒試樣100 mL，立即轉移至蒸餾器內蒸餾，在3 min內完成樣品蒸餾，收集餾出液至25 mL容量瓶中，定容，搖勻。

吸取10 mL 餾出液于2 支25 mL 比色管中，于其中1支比色管中加入鄰苯二胺溶液0.5 mL，另1支不加，作為空白。蓋塞搖勻，置于暗處反應20 min。于樣品管中加4 mol/L 鹽酸溶液2 mL，于空白管中加4 mol/L 鹽酸溶液2.5 mL，蓋塞混勻。用10 mm石英比色皿，在335 nm 下，以空白管做參比，測定試樣的吸光度。

1.2.2 啤酒中雙乙酰的測量不確定度評定

依據JJF 1059.1—2012[6]評定不確定度。

1.2.3 啤酒中雙乙酰的合格概率評定

依據CNAS-TRL-010：2019[8]中的計算公式計算合格概率。

2 結果與分析

2.1 啤酒中雙乙酰含量的測量結果

在重復性條件下，對樣品進行10 次測量，測量結果分別為0.120 mg/L、0.139 mg/L、0.162 mg/L、0.131 mg/L、0.157 mg/L、0.170 mg/L、0.146 mg/L、0.132 mg/L、0.150 mg/L、0.126 mg/L，測量平均值為0.143 mg/L，吸光度平均值為：0.0597。

2.2 測量不確定度的評定

2.2.1 數學模型的建立

試樣中雙乙酰含量的數學模型為：

式中：X 為試樣中雙乙酰的含量(mg/L)；A 為樣品吸光度；2.4為吸光度與雙乙酰含量的換算系數。

2.2.2 測量不確定度來源分析

分析檢驗過程和數學模型，試樣中雙乙酰含量的測量不確定度來源見圖1。

圖1 啤酒中雙乙酰含量的測量不確定度來源

2.2.3 取樣體積引入的相對不確定度Urel(V1)

查詢JJG 130—2011《工作用玻璃液體溫度計》[11]，100 mL 量筒量取5 ℃的酒樣時，溫度計測量酒樣的溫度誤差為±0.5 ℃；酒樣的膨脹系數按照水膨脹系數考慮，為2.1×10-4℃-1；溫度波動引入的誤差按照均勻分布考慮，包含因子k取。

查詢JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》[12]，得到玻璃量器的容量允差。CNAS-GL006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》[13]推薦玻璃量器的容量誤差概率密度函數采用三角分布,包含因子k取。

記錄實驗過程中，實驗室溫度波動為20 ℃±4 ℃。

實驗過程中，由玻璃量器容量誤差與溫度誤差引入的相對不確定度見表1。

表1 玻璃量器容量誤差與溫度誤差引入的相對不確定度

由檢驗過程取樣體積引入的不確定度來自（1）100 mL量筒量取100 mL酒樣引入的誤差；（2）25 mL容量瓶定容體積誤差；（3）移液管吸取10 mL 餾出液的體積誤差。

取樣體積引入的相對不確定度Urel(V1)：

2.2.4 定容體積引入的相對不確定度Urel(V2)

由檢驗過程可知用于比色的液體總體積（定容體積）引入的不確定度來自（1）移液管吸取10 mL餾出液的體積誤差；（2）移液管吸取0.5 mL 鄰苯二胺溶液的體積誤差；（3）移液管吸取2 mL的4 mol/L鹽酸溶液的體積誤差。

定容體積引入的相對不確定度urel(V2)：

2.2.5 分光光度計引入的不確定度

朗伯-比爾定律的數學表達式在JJG 178—2007《紫外、可見、近紅外分光光度計檢定規程》[14]條款“3 概述”中有具體定義，數學表達式為：A1=-lgT；式中：A1為吸光度；T為透射比。

對試樣重復測量10 次，10 次測量的平均吸光度為0.0597，代入公式，計算得出透射比T 的平均值為0.8752。分光光度計計量性能級別為Ⅱ級，檢定合格，查詢JJG 178—2007[14]得知儀器透射比最大誤差為±0.5%，誤差概率密度函數分布假設為均勻分布，包含因子k取。則由儀器透射比引入的不確定度為u(T)==2.526×10-3。

吸光度的靈敏度系數：

分光光度計誤差引入的不確定度分量：

2.2.6 測量重復性引入的不確定度分量[6]

重復性試驗的標準偏差：

測量重復性引入的不確定度：

測量重復性引入的相對不確定度：

2.2.7 合成相對標準不確定度

2.2.8 標準不確定度

2.2.9 擴展不確定度和結果表示

在95 %包含概率下，包含因子k=2，擴展不確定度：U＝k×u＝2×0.006＝0.012 mg/L。

雙乙酰含量測量結果表示為：X＝(0.143±0.012)mg/L，k＝2。

2.3 計算雙乙酰含量的合格概率

查詢啤酒國家標準GB/T 4927—2008[9]，得到一級啤酒雙乙酰的限量值為≤0.15 mg/L，依據CNAS-TRL-010：2019[8]中的合格概率公式，求得合格概率：

查閱GB 4086.1—1983《統計分布數值表正態分布》[15]標準正態分布表，合格概率Pc=87.9%。

3 結論與討論

GB/T 4928—2008[10]中雙乙酰的測定方法并沒有繪制標準曲線而是直接測定樣品吸光值求得雙乙酰含量，對于其測量不確定度的評定，本研究通過朗伯-比爾定律計算公式解決了這一問題。本次測量不確定度的評定過程對與同類型檢驗的測量不確定度評定也具有一定參考意義。

本次測量測量值小于限量值，在不考慮測量不確定度時，符合性判定可判定為合格；在考慮測量不確定度時，測量真值在95 %的置信概率下處于區間[0.131,0.155]。同樣的樣本，經由其他實驗室測量或者改變測量條件時，測量值可能超過0.15 mg/L，此時就有可能給出不合格的符合性判斷結論。依據上文中計算，啤酒試樣中雙乙酰合格概率為87.9%，所以有12.1%的概率超過0.15 mg/L。

為便于啤酒生產企業控制雙乙酰的含量，以確保在給定的合格概率下符合性判定為合格，給定一個合格概率，計算出雙乙酰的控制值是迫切需要關注的問題，接下來展開討論：

CNAS-TRL-010：2019[8]步驟5.4 指出：在通常情況下選取95 %合格概率下的保護帶。查詢GB 4086.1—1983[15]中的標準正態分布表，當合格概率大于95%時，函數取值需≥1.65，若測量不確定度按照本次的評定值來考慮，則≥1.65，求得y≤1.49 mg/L。也就是說當雙乙酰的測量值≤1.49 mg/L時，雙乙酰含量的合格概率≥95%。

對于啤酒或者白酒等產品質量控制中的其他檢驗項目（如酒精度、原麥汁、總酸、氰化物、甜蜜素、甲醇等），企業可以根據實際工作需要確定其合格概率，參考文中的方法制定控制值。