清香型白酒釀造中乳酸乙酯和乙酸乙酯合成代謝調控的研究進展

李書婷，黃志久，吳正云，賈代榮，楊 波，張文學

（1.四川大學輕工科學與工程學院，四川成都 610065；2.醉清風酒業股份有限公司，四川瀘州 646000）

乙酸乙酯與乳酸乙酯是清香型白酒的主要香味物質，它們的含量和比例與清香型酒的風味品質密切相關[1]。乙酸乙酯偏低和乳酸乙酯偏高是影響清香型白酒品質的常見問題[2]。就乳酸乙酯而言，在白酒生產過程中，空氣、酒曲、酒醅以及開放的發酵方式都可能帶入乳酸菌，從而產生大量乳酸，導致乳酸乙酯含量上升[3-4]。目前降低乳酸乙酯含量的研究主要關注發酵環境和餾酒條件的優化[5]。在乙酸乙酯含量提高方面，主要采取篩選優良酵母菌株的方式?？傮w上看，從代謝調控角度探討降低乳酸乙酯含量和提高乙酸乙酯含量的研究相對較少。本文綜述了近年來清香型白酒中乳酸乙酯與乙酸乙酯合成代謝調控方面的研究進展，為提升清香型白酒品質提供理論參考。

1 白酒中乳酸乙酯和乙酸乙酯的合成途徑

釀酒過程中，白酒中的乳酸乙酯和乙酸乙酯可通過化學反應或生物合成。生物合成又分為醇酰基轉移酶途徑和酯化酶途徑。

1.1 化學反應

白酒發酵過程中會產生酸、醇等底物，酸與醇發生酯化反應生成酯類和水。酯化反應屬于可逆反應，一般情況下反應不徹底并且速度極緩慢。在白酒發酵后期，酸、醇大量積累，有利于酯化反應的進行。白酒生產和貯藏過程中，可以通過延長發酵周期促使白酒中酯化反應達到平衡[6]。

1.2 醇?；D移酶途徑

醇?；D移酶(Alcohol acetyl transferase)廣泛存在于酵母、植物和細菌中[7]，能催化不同醇與?；o酶A 生成相應的酯類物質。目前關于植物來源的醇?；D移酶研究已比較充分[8]。與釀酒相關的醇?；D移酶主要存在于酵母[9]（包括釀酒酵母、克魯維氏酵母、巴氏酵母等）中，目前的研究主要集中于釀酒酵母。釀酒酵母在發酵過程中不能合成乳酰CoA[10]，通過此途徑合成的乳酸乙酯產量微乎其微。但對于乙酸乙酯而言醇?；D移酶途徑是主要合成途徑[11-12]（圖1）。與乙酸乙酯合成相關的醇酰基轉移酶主要有Atf1p、Atf2p、Lg Atf1p[13-15]。研究表明，釀酒酵母中Atf1的敲除導致乙酸乙酯的形成減少40%，Atf2 的敲除僅導致乙酸乙酯減少13%，顯示Atf1p 在乙酸乙酯的形成中作用更大[11，16]。此外，位于酵母線粒體中的醇酰基轉移酶Eat1p 也可催化乙酰CoA 與乙醇反應生成乙酸乙酯[17]。Mans等[18]用CRISPR-Cas9 破壞釀酒酵母中Eat1p 同源物，乙酸乙酯的產量減少了50%。

圖1 胞中乙酸乙酯合成的醇?；D移酶途徑[17，19]

1.3 酯化酶途徑

酯化酶是催化合成低級脂肪酸酯酶類的總稱，包括脂肪酶、酯合成酶和磷酸酯酶[20]。在白酒釀造中，酯化酶的產生菌主要是霉菌（紅曲霉、毛霉、根霉等），其次為酵母菌（釀酒酵母、假絲酵母、球擬酵母等）[21]。目前關于酯化酶的研究大多集中于濃香型白酒中的己酸乙酯，武建國等[22]在酒醅中加入紅曲酯化酶發酵后，己酸乙酯含量增加了124.8～162.5 mg/100 mL；許春艷等[23]發現紫色紅曲霉YJX-8 酯化酶對己酸的酯化較對丁酸、乙酸的酯化作用更強；胡沂淮等[24]以洋河大曲中篩選到的紫紅曲霉生產得到酯化紅曲粗酶制劑，具有較高的己酸乙酯催化活性。酯化酶也能催化乙酸、乳酸等小分子酸與乙醇反應生成乙酸乙酯和乳酸乙酯等[21]。酯化酶的催化選擇性在一定程度上受底物濃度和環境因子的影響，如對不同香型大曲酯化酶催化特性的研究顯示，當乙酸濃度為25 g/L、pH4 時，催化合成乙酸乙酯的活力最高；當乳酸濃度為5 g/L、pH7 時，催化合成乳酸乙酯的活力最高[25]。由于酯化酶的種類繁多且催化特異性規律不完全清晰，目前很少有從酯化酶途徑探討白酒中乳酸乙酯與乙酸乙酯代謝調控的研究。深入探究各種酯化酶的催化特性和作用機制，對白酒酯類物質代謝調控的深入理解和實際應用有積極意義[26]。

2 乳酸乙酯與乙酸乙酯合成代謝的調控

乳酸乙酯在蒸酒前期溫度較低、酒度較高時餾出較少；乙酸乙酯分子極性較小，較難溶于水，可以完全溶于乙醇，在蒸酒前期餾出相對較多[27-28]。因此可以采用高酒度摘酒方式降低成品酒中的乳酸乙酯含量。但此種方式會造成蒸餾后期其他重要風味物質的丟失，成品酒口感欠佳，減少原酒產量[3]。從代謝調控角度考慮，增加乙酸乙酯和減少乳酸乙酯含量的方式有以下幾種。

2.1 改變前體物質的含量

乳酸乙酯通常是由乳酸菌代謝產生的乳酸和酵母菌代謝產生的乙醇作為前體物質合成，因此可以考慮通過降低前體物質乳酸的含量減少乳酸乙酯[29]的生成。乳酸降解菌（或稱為乳酸利用菌）是能夠利用乳酸作為碳源或者電子受體的一類微生物，最終降解產物有酯類、酸類和醇類[30]。目前已報道的乳酸降解菌有芽孢桿菌屬、丙酸桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬等[30-32]。不同種屬的菌株對乳酸的降解率差異很大，目前與芽孢桿菌有關的研究相對較多。鎮達等[33]從大曲、黃水、酒醅中篩選到了16株可利用乳酸的芽孢桿菌；李偉等[34]從清香型大曲中篩選到兩株芽孢桿菌B4-1 和B36-1，乳酸利用量分別達到1.91 g/L 和1.26 g/L；宋克偉等[35]將從清香型大曲中篩選到的枯草芽孢桿菌B001 添加到酒醅中進行發酵，乳酸乙酯降低了25%，并在感官品評中體現了清香型白酒爽凈、柔順等特點；楊望軍[3]將從酒醅中篩選到的兩株芽孢桿菌制成固體麩曲應用于生產，乳酸乙酯降低率分別為11.25 %和15.83%。從白酒生產環境中分離篩選乳酸降解菌添加到白酒發酵中，能夠降低乳酸和乳酸乙酯含量，改善酒體品質，具有很好的應用前景[36]。

乙酸乙酯含量的提升可通過增加前體乙酸實現。王文陽等[37]在酒醅中添加3.0 mg 醋酸/g 醅的醋酸發酵液，白酒中的乙酸和乙酸乙酯含量分別提高了138.35 %和85.43 %；張華東等[38]在高粱汁培養基內接種不同濃度的醋酸菌懸濁液，探討其對釀酒酵母酯醇代謝的影響，當醋酸菌接種量為3×109CFU/mL 時，乙酸乙酯含量增加12 %。醋酸菌是好氧微生物，隨著發酵的進行，氧氣耗盡，醋酸菌逐漸凋亡，因此添加醋酸菌懸濁液對提高乙酸乙酯含量的效果不及直接添加醋酸發酵液。

2.2 通過菌株選育提高乙酸乙酯含量

一般認為白釀酒造中的酵母菌與乙酸乙酯形成有密切關系，通過篩選高產乙酸乙酯的酵母菌株提高白酒中乙酸乙酯含量的研究報道較多。陳雪等[39]篩選到一株高產乙酸乙酯的酵母菌株，制成麩曲應用于高粱固態發酵試驗，使乙酸乙酯的含量提高了19.5 %；程偉等[40]在清香型酒醅中篩選得到1株高產乙酸乙酯的酵母菌jmz-01，產乙酸乙酯能力為248.9 mg/L；許銀等[41]將篩選到的酵母菌Y87與麩皮按質量比3∶100 添加到酒曲中，乙酸乙酯含量提高36.6 %；劉小改等[42]將篩選到的酵母菌J-4用于發酵，乙酸乙酯含量提高了50.7%。盡管篩選菌株的方法能有效提高成品酒中乙酸乙酯的含量，但其具體機制的研究報道很少。前文所述，醇?；D移酶是乙酸乙酯合成的主要途徑，猜測高產乙酸乙酯的菌株可能具有更高的醇酰基轉移酶活性。

除篩選優良菌株之外，使用基因工程技術改造菌株也可以達到提高乙酸乙酯產量的效果，其主要原理是加強合成乙酸乙酯的醇?；D移酶途徑。Cui 等[43]在釀酒酵母中過表達醇?；D移酶基因ATF1，產乙酸乙酯達270.24 mg/L，是親本的27.21倍；Dong等[44]過表達釀酒酵母ATF1，使乙酸乙酯的產量從25.04 mg/L 提高到78.76 mg/L；Li 等[45-46]構建過量表達ATF1 和ATF2 的釀酒酵母菌株，乙酸乙酯產量分別達到1353.45 mg/L 和73.40 mg/L，是出發菌株的43.16 倍和2.34 倍；馬紅霞等[47]將過表達醇乙酰基轉移酶的釀酒酵母MY15 應用于清香型白酒釀造,乙酸乙酯的總量提高了70%；Kruis 等[48]在釀酒酵母中過表達Eat 基因家族，15 個過表達菌株中有10 株顯示乙酸乙酯的產量增加。盡管通過基因工程改造菌株能大幅度提高白酒中乙酸乙酯的含量，但目前此種方式在實際生產中的應用受到相關法規的限制。

2.3 添加乳酸菌及其代謝抑制劑降低乳酸乙酯含量

乳酸菌是釀酒過程中產生乳酸的主要微生物，因此可以考慮在酒醅中抑制乳酸菌生長從而減少乳酸的含量。龔士選[49]在西鳳酒入池酒醅中加入3～5 kg/萬斤酒醅的延胡索酸進行發酵實驗，乳酸乙酯從150 mg/100 mL 降低至50～80 mg/100 mL，降乳效果明顯，且酒質柔和，風格突出。乳酸菌生長的抑制劑很多，但選擇性不強，可能擾亂正常的釀造發酵過程。如能尋找或開發出特異性的乳酸菌抑制劑，對于白酒生產中乳酸乙酯含量的降低更具有實際意義。

增強非乳酸代謝途徑也是減少乳酸含量的方式之一。如添加琥珀酸脫氫酶的輔基黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），可以促進琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，加速三羧酸循環，使代謝流向非乳酸生成途徑。白希智等[50]將FAD 與大曲粉按比例混勻，添加到酒醅中，發酵40 d后，乳酸乙酯降低27.26%，己酸乙酯略有增加，對其他香味物質無明顯影響，感官品評結果良好。目前在乳酸代謝抑制方面的主要方式是增強三羧酸循環，使丙酮酸更多流向非乳酸代謝途徑，但這一方式在厭氧發酵條件下的應用受到限制。

3 結語

本文綜述了清香型白酒中乳酸乙酯與乙酸乙酯的合成途徑，并從代謝前體和關鍵酶活性的角度，總結了乳酸乙酯與乙酸乙酯合成代謝調控的3種方式。總體上看，除通過基因工程技術增強醇?；D移酶活性提升乙酸乙酯含量外，其他方式基本屬于工藝優化等初步探討，相關調控機制的理解和應用還有待進一步深入探究。