UPLC-MS/MS 法測定白酒中三氯蔗糖含量的不確定度分析

黃永橋，吳新文，張世芹，簡銀池，毛敏霞

（貴州省檢測技術研究應用中心，貴州貴陽 550014）

三氯蔗糖（Sucralose）又名蔗糖素，是一種非營養(yǎng)型強力甜味劑，為蔗糖甜度的600 倍，無能量，熱量值為零，為減肥人群及血糖異常人群所喜愛，被廣泛應用于飲料、調味料、糕點等食品中[1-3]。研究表明，三氯蔗糖可以影響人體代謝，具有一定的慢性毒性、生殖毒性，會增加患癌癥的風險，并且對生態(tài)環(huán)境存在潛在影響[4-6]。GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規(guī)定配制酒中三氯蔗糖的最大允許限量為0.25 g/kg，但在白酒中不得添加。

目前三氯蔗糖的檢測方法有：液相色譜法[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[9-10]、氣相色譜法[11]、滴定法[12]和離子色譜法[13-14]等。液相色譜-串聯(lián)質譜法具有較強的選擇性和抗干擾能力、較高的靈敏度等優(yōu)點。現(xiàn)有三氯蔗糖的檢測方法為GB 22255—2014《食品安全國家標準食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》，現(xiàn)階段采用液質聯(lián)用法測定白酒中三氯蔗糖的不確定度評定的報道較少。研究參照現(xiàn)有測量分析過程中不確定度評定方法和要求，對超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定白酒中三氯蔗糖含量的不確定度進行分析評定[15-16]。根據(jù)分析測量過程中不確定度的來源，建立的數(shù)學模型并對其進行不確定度評估，計算合成相對不確定度，得到最終的擴展不確定度，以期為測量結果的準確性提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售蒸餾白酒樣品。

試劑及耗材：乙腈（色譜純），德國Merck 公司；甲酸（色譜純），上海安普實驗科技股份有限公司；三氯蔗糖（純度＞99%），上海安譜實驗科技股份有限公司。

儀器設備：Agilent 1290 超高效液相色譜儀、Agilent 6470 QQQ 三重串聯(lián)四級桿質譜（配有ESI源），美國Agilent 公司；LT2002 電子天平，常熟市天量儀器有限公司；UMV-2 多管渦旋混合器，北京普立泰科儀器有限公司；Milli-Q 超純水機，美國Millipore 公司；0.22 μm 有機濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

標準儲備溶液配制：準確稱取三氯蔗糖標準品10 mg（精確至0.0001 g），純水溶解并定容至10 mL，得到濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus-C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Agilent 公司)色譜柱；流動相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈，流速：0.3 mL/min，柱溫：40 ℃，進樣體積：2.0 μL，梯度洗脫程序：0.0～0.5 min，20 %B；0.5～1.0 min，20 %～80 %B；1.0～2.0 min，80 %B；2.0～2.5 min，80 %～20 %B；2.5～3.5 min，20%B。

1.2.2.2 質譜條件

電噴霧離子源，負離子掃描；多反應監(jiān)測；毛細管電壓：4.5 kV；霧化器壓力：45 psi；干燥氣流速：7 L/min；干燥氣溫度：325 ℃；鞘氣流速：10 L/min；鞘氣溫度：300 ℃；三氯蔗糖質譜參數(shù)：錐孔電壓130 V，母離子m/z 397，定量離子m/z 360.8，碰撞能量8 eV，母離子m/z 395，定量離子m/z 358.8，碰撞能量6 eV。

1.2.3 樣品前處理

準確稱取5 g 試樣（精確至0.01 g）置于50 mL燒杯中，沸水浴上蒸干，殘渣用11%乙腈溶液溶解并轉移至25 mL 容量瓶中，定容后過膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜分析。

1.2.4 建立不確定度數(shù)學模型

式中：X——試樣中三氯蔗糖的含量，μg/kg；

C——三氯蔗糖質量濃度，ng/mL；

V——試樣溶液定容體積，mL；

m——試樣質量，g；

1.2.5 測量不確定度來源

測量三氯蔗糖的不確定度來源主要有標準溶液引入的不確定度和樣品前處理引入的不確定度，標準溶液引入的不確定度包括：標準物質純度、標準儲備液、標準中間液和標準工作液的配制、標準曲線擬合；樣品前處理引入的不確定度包括：樣品稱樣、樣品前處理、測量重復性和加標回收率。

注：文中后續(xù)陽性樣品表示經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)白酒樣品中含有三氯蔗糖，陰性樣品表示經(jīng)檢驗未發(fā)現(xiàn)白酒樣品中含有三氯蔗糖。

2 結果與分析

2.1 標準溶液配制過程引入的不確定度urel(S)

2.1.1 標準物質引入的不確定度

根據(jù)標準物質證書上的信息，三氯蔗糖標準物質純度為98.79 %，不確定度為±1 %，符合均勻分布，包含因子k=，因此相對標準不確定度為：

2.1.2 標準儲備液配制引入的不確定度urel(S2)

2.1.2.1 標準品稱量引入的不確定度urel(w)

稱量所用分析天平檢定證書給出允差為±0.1 mg，符合均勻分布，k=，當標準品稱量為10 mg，引入相對標準不確定度為：

2.1.2.2 標準儲備液配制過程中器具引入的不確定度urel(std1)

標準儲備液配制過程引入不確定度有10 mL單標線容量瓶（A 級）的容量允差和實驗室溫度變化引起的溶劑和玻璃容器體積膨脹。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中可知，10 mL 單標線容量瓶（A 級）容量允差為±0.020 mL，實驗室溫度在（20±5）℃之間變動時，查得水和玻璃的膨脹系數(shù)分別為0.000208/℃和0.0000250/℃，玻璃的體積膨脹系數(shù)相較水的體積膨脹系數(shù)可忽略不計，符合均勻分布k=，則10 mL 單標線容量瓶（A 級）的容量允差不確定度urel(n1)和水的體積膨脹不確定度urel(n2)為：

因此，標準儲備液配制過程中器具引入的相對標準不確定度為：

綜上，標準儲備液配制引入的相對標準不確定度為：

2.1.3 標準中間液配制引入的不確定度urel(S3)

吸取標準儲備溶液0.10 mL 于100 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，得到1.0 μg/mL標準中間溶液。

配制過程引入不確定度有1 mL分度吸量管（A級）的容量允差、10 mL 單標線容量瓶（A 級）的容量允差和因實驗室溫度變化引起的溶劑體積膨脹。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中可知，1 mL 分度吸量管（A 級）容量允差和10 mL單標線容量瓶（A 級）容量允差為±0.008 mL 和±0.020 mL，實驗室溫度在（20±5）℃之間變動時，水的體積膨脹系數(shù)為0.000208/℃，符合均勻分布k=，標準中間液配制過程引入的不確定度見表1。

表1 標準中間液配制過程引入的不確定度

因此，標準中間液配制引入的相對標準不確定度為：

2.1.4 標準工作液配制引入的不確定度urel(S4)

分別吸取標準中間液5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL 于10 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，混勻，得到質量濃度為0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL 的標準系列工作液。

配制過程引入不確定度有不同量程移液器的容量允差、10 mL 單標線容量瓶（A 級）的容量允差和因實驗室溫度變化引起的溶劑體積膨脹。根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》、JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》和實驗室溫度在（20±5）℃之間變動時水的體積膨脹系數(shù)，符合均勻分布k=，標準工作液配制過程引入的不確定度見表2。

表2 標準工作液配制過程引入的不確定度

因此，標準工作液配制引入的相對標準不確定度為：

2.2 標準曲線擬合引入的不確定度urel(C)

配制的標準工作液經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質譜儀進行測定，重復測定3 次，以質量濃度對其峰面積通過直線擬合得到標準曲線，線性回歸方程：y=159478c-111279，相關系數(shù)0.998。測定結果見表3。

表3 標準工作液峰面積測定結果

選取陽性樣品重復測定6 次，將峰面積帶入線性方程校正其含量，測得陽性樣品中三氯蔗糖平均含量為C0=12.18 ng/mL，標準曲線擬合引入的標準不確定度計算按公式（2），相對標準不確定度計算按公式（3）。

k——線性方程斜率，k= 159478；

b——線性方程截距，b=- 111279；

n——樣品平行測定次數(shù)，n=6；

p——標準工作液各濃度點重復測定的次數(shù)，每個濃度點重復測定3次，p=18；C0——樣品溶液的平均質量濃度，C0=12.18 ng/mL；

經(jīng)計算，樣品測定引入的標準不確定度u(C)為0.180 ng/mL，相對標準不確定度urel(C)為0.0148。

2.3 樣品前處理引入的不確定度urel(P)

2.3.1 稱樣引入的不確定度urel(P1)

稱取5 g 白酒試樣（精確至0.001 g），根據(jù)JJG 1036—2008《電子天平檢定規(guī)程》，最大允許誤差為±0.005 g，符合矩形分布k=，則相對標準不確定度為：

2.3.2 樣品定容引入的不確定度urel(P2)

樣品最終使用11%乙腈溶液溶定容至25 mL，根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，25 mL 單標線容量瓶（A 級）容量允差為±0.030 mL，20 ℃時乙腈和水的體積膨脹系數(shù)分別為0.00137/℃和0.000208/℃，用于定容的11 %乙腈溶液溶的體積膨脹系數(shù)為0.000336/℃，服從矩形分布k=，則25 mL 單標線容量瓶（A 級）的容量允差不確定度urel(n3)和11 %乙腈溶液溶的體積膨脹不確定度urel(n4)為：

因此，樣品定容過程引入的相對標準不確定度為：

綜上，樣品前處理引入的不確定度為：

2.4 測量重復性引入的不確定度urel(A)

同時稱取陽性樣品6份，按照1.2前處理方法進行前處理，計算6 次重復性結果和平均值。結果分別為59.5 μg/kg、59.9 μg/kg、59.7 μg/kg、61.9 μg/kg、60.0 μg/kg、62.4 μg/kg，平均值為60.6 μg/kg，相對標準不確定度計算按公式（4）。

經(jīng)計算，測量重復性引入的相對標準不確定度urel(A)為0.00829。

2.5 回收率引入的不確定度urel(R)

取陰性樣品進行加標回收試驗，按1.2 樣品前處理進行處理，平行測定6 次，加標回收率統(tǒng)計結果見表4。

表4 加標回收試驗結果(n=6)

加標回收率引入的相對標準不確定度為：

為確定在三氯蔗糖含量的計算中是否需要折算平均回收率，根據(jù)CNAS—GL006《化學分析中不確定度的評估指南》，用t檢驗來確定平均回收率與1.0是否有顯著性差異：

查JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》t 分布表，取95 %置信度，n-1 自由度的臨界值t95（5）為2.57，故t＞t95（5），說明平均回收率與1.0 具有顯著性差異，因此在結果計算中需采用回收率對結果進行修正。

2.6 分析過程中不確定度分量及合成相對標準不確定度urel(X)

經(jīng)過對白酒中三氯蔗糖分析過程中不確定度進行分析和計算，過程中各相對標準不確定度來源、類型和數(shù)值見表5。

表5 不確定度分量

白酒中三氯蔗糖分析過程中的合成相對標準不確定度為：

2.7 擴展不確定度

依據(jù)JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》，取95%置信水平，擴展因子k=2，白酒中三氯蔗糖含量的平均值為60.6 μg/kg，則擴展不確定度：

2.8 測量結果及不確定度報告

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定白酒中三氯蔗糖含量，根據(jù)不確定度評定結果，當稱樣量為5 g，置信度為95 %時k=2，測定結果為：（60.6±6.5）μg/kg，k=2。

3 結論

采用UPLC-MS/MS 法測定白酒中三氯蔗糖含量，通過對測定過程中不確定度來源進行分析并量化，結果表明，影響白酒中三氯蔗糖測定結果不確定度的因素主要有：標準溶液配制、標準曲線擬合、樣品前處理、測量重復性和加標回收率，其中測量重復性和加標回收率的不確定度對合成相對標準不確定度的貢獻較小，標準溶液配制和標準曲線擬合不確定度評定結果最大。因此，在測定白酒中三氯蔗糖時應注意操作的規(guī)范性，選擇適當量程的量具，準確配制標準溶液，定容準確，減少測量過程不確定度，提高檢測結果的準確度和可信度。