2株海豚鏈球菌的分離鑒定及藥敏特性分析

張鳳賢

(河北省水產技術推廣總站，河北 石家莊 050035)

鱘魚屬于硬骨魚綱、硬鱗總目、鱘形目，具有個體大、生長快、適應性強等優點[1]，其肉厚骨軟，味道鮮美，肉和卵的蛋白質含量高，是高級營養品，具有極高的經濟價值。當前鱘魚養殖產業得到迅速發展，養殖規模不斷擴大，在養殖規模和產量不斷擴大的同時，養殖環境也發生了巨大變化，高密度養殖、水體惡化，細菌病不斷發生，直接影響鱘魚養殖的發展。根據報道和文獻研究，目前，鱘魚細菌病的主要致病菌有：金黃桿菌(Chryseobacteriumsp.)[2]、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)[3]、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[4-5]、遲鈍愛德華氏菌[6]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[7]、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)[8]、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[9]等。

海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)屬于芽孢桿菌綱，乳桿菌目，鏈球菌科，鏈球菌屬，具有感染宿主廣、傳染性強、死亡率高等特點，為球形或卵圓形，直徑0.2～0.8 μm，為革蘭氏陽性菌，在水體中普遍存在，是人魚共患病原菌。在20世紀70年代海豚鏈球菌開始被人們認知，20世紀90年代鏈球菌屬細菌對魚類疾病的感染危害加重，成為全球重要的魚類病原菌，易感染的魚類有：鱘魚、虹鱒、羅非魚、黃鰭鯛、黃顙魚、鯧鲹等，且從當年魚種至成魚均受害，海豚鏈球菌感染流行于夏季，死亡率高[10]。

2020年河北省鱘魚養殖面積約113 hm2，年產量約6 900多噸，且大規模養殖主要集中在石家莊、邯鄲和保定地區[11]。近幾年，石家莊地區鱘魚海豚鏈球菌感染屢有發生，所以對海豚鏈球菌感染及海豚鏈球菌藥物敏感特性研究對于該地區實際生產中海豚鏈球菌感染鱘魚的防治具有非常重要的意義。

本文結合國務院獸醫主管部門批準的水產養殖用獸藥，采用微量肉湯法對分離獲得的病原菌菌株進行藥敏試驗，篩選出敏感抗生素，用于實際水產養殖中指導養殖戶對鱘魚海豚鏈球菌感染疾病合理使用抗生素治療。

1 材料與方法

1.1 材料

腦心浸液(BHI)肉湯培養基、BHI營養瓊脂培養基購自美國BD公司，細菌生化鑒定管及配套相關試劑購自青島海博生物技術有限公司，藥敏分析試劑板購自南京菲恩醫療科技有限公司，PCR相關試劑購自TakaRa公司?；疾△\魚分別取自河北省石家莊市井陘縣及平山縣兩個鱘魚養殖場。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 2021年7月和8月，河北省石家莊市井陘縣和平山縣分別有一鱘魚養殖場發生鱘魚發病大量死亡的情況，發病鱘魚臨床癥狀主要表現為：嘴部發紅發黑，肛門紅腫，鰓蓋及鰭條基部出血；解剖可見腹部出血、肝脾腫大。對2個養殖場分別選取具有典型發病癥狀的鱘魚，無菌條件下解剖，無菌接種環取其肝臟、脾臟、腎臟組織，分別劃線于BHI固體培養基進行病原菌的分離培養，25 ℃，培養72 h，選取優勢菌落，純化培養3次，各獲得1株純化菌株，并分別命名為JX-1和PS-3。將純化菌株JX-1和PS-3分別挑取單菌落于BHI液體培養基中，25 ℃，振蕩培養24～48 h，保存甘油菌(25%甘油濃度)于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 病原菌的形態和生理生化特性鑒定試驗 觀察菌株JX-1和PS-3在BHI固體培養基上的菌體形態特征，并進行革蘭氏染色，鏡檢觀察；利用細菌生化鑒定管，根據鑒定管使用說明書對2菌株分別進行生理生化特性鑒定。

1.2.3 病原菌的16S rDNA序列分析 對菌株JX-1和PS-3進行基因組DNA提取，然后采用通用引物(27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R: 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)進行PCR擴增，獲得16S rDNA序列產物，PCR產物送派諾森生物科技有限公司進行基因測序，測序結果與NCBI Blast數據庫中的序列進行比對分析，確定種屬。

1.2.4 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法分別對菌株JX-1和PS-3進行藥物敏感性試驗，根據國務院獸醫主管部門批準的水產養殖用獸藥品種(恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環素、氟甲喹、磺胺甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶)定制專用藥敏分析試劑板，具體操作方法依照藥敏分析試劑板使用說明書進行。當試劑板中陽性對照組細菌生長良好時，肉眼觀察能夠抑制細菌生長的最低藥物濃度，作為該藥物對受試菌的最小抑菌濃度(MIC)。

2 結果與分析

2.1 菌株JX-1和PS-3的形態和生理生化特性

菌株JX-1和PS-3在BHI固體培養基中生長乳白色、圓形、針尖大小的菌落，邊緣整齊，表面光滑，不透明。經革蘭氏染色為革蘭氏陽性鏈球菌(見封三圖1)。

菌株JX-1和PS-3的生理生化特性鑒定結果見表1。

由表1可知，菌株JX-1和PS-3可分解利用甘露醇，不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖；不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚；不產生苯丙氨酸脫氨酶；有動力；可產生鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶；發酵不產生硫化氫；不產生尿素酶；不可以利用檸檬酸鹽；MR、VP試驗陰性。

根據《常見細菌系統鑒定手冊》[12]，菌株JX-1和PS-3的形態特征和生理生化特性與海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)高度相似。

2.2 菌株JX-1和PS-3的16S rDNA序列分析結果

根據測序結果，與NCBI Blast數據庫中的序列比對分析，發現菌株JX-1和PS-3與海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)的同源性均大于99.0%。

綜合菌株JX-1和PS-3的形態特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析結果，確定菌株JX-1和PS-3為海豚鏈球菌。

2.3 藥敏試驗結果

根據菌株JX-1和PS-3的藥敏試驗結果，獲得各藥物對2菌株的最小抑菌濃度MIC(見表2)。

表2 各藥物對菌株PS-3和JX-1的MIC μg/mL

由表2最小抑菌濃度MIC可知，菌株JX-1對硫酸新霉素、甲砜霉素、鹽酸多西環素、磺胺甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶高度敏感，對氟苯尼考中度敏感，對恩諾沙星、氟甲喹耐藥；菌株PS-3對甲砜霉素、鹽酸多西環素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶高度敏感，對硫酸新霉素、氟苯尼考中度敏感，對恩諾沙星、氟甲喹耐藥。根據表2數據可知，恩諾沙星對JX-1的MIC是16.00 μg/mL，對PS-3的MIC是8.00 μg/mL，2菌株對恩諾沙星均耐藥；硫酸新霉素對JX-1的MIC≤0.125 μg/mL，對PS-3的MIC是1.00 μg/mL，JX-1對硫酸新霉素高度敏感，PS-3對硫酸新霉素中度敏感；2菌株對其他抗生素的敏感性差異不大。

3 討論

海豚鏈球菌作為當前河北省石家莊地區鱘魚主要感染鏈球菌種類，其特性研究和防治對鱘魚類生產養殖工作非常重要。

本文通過對菌株JX-1和PS-3的生理生化特性研究，發現2菌株可分解利用甘露醇，不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖，不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，不產生苯丙氨酸脫氨酶，有動力，可產生鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，發酵不產生硫化氫，不產生尿素酶，不可以利用檸檬酸鹽，MR、VP試驗陰性。其他特性待進一步研究。

通過藥敏試驗結果發現，菌株JX-1對硫酸新霉素、甲砜霉素、鹽酸多西環素、磺胺甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶高度敏感，對氟苯尼考中度敏感，對恩諾沙星、氟甲喹耐藥；菌株PS-3對甲砜霉素、鹽酸多西環素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶高度敏感，對硫酸新霉素、氟苯尼考中度敏感，對恩諾沙星、氟甲喹耐藥。根據國務院獸醫主管部門批準的水產養殖用獸藥，進行藥敏試驗，試驗結果可以更好地指導水產養殖中感染海豚鏈球菌的治療，有效預防和控制濫用藥和過量用藥現象的發生。

由最小抑菌濃度可知，作為石家莊地區兩個相鄰區域獲得的2株病原菌JX-1和PS-3對各抗生素的耐藥性差異不大，JX-1對硫酸新霉素高度敏感，而PS-3對硫酸新霉素中度耐藥，說明相鄰地域的致病菌的耐藥性差異不大。

4 結論

在石家莊市兩相鄰地區分離獲得的2株海豚鏈球菌，對抗生素的藥物敏感性差異較小，在水產養殖實際生產中，對于石家莊區域內鱘魚海豚鏈球菌的感染，可以利用甲砜霉素、鹽酸多西環素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶等抗生素進行治療，且感染早期用藥效果更佳。