水蛭來源熒光假單胞菌的分離鑒定及系統發育樹分析

王淑嫻，許 拉，樊 英，王友紅，葉海斌，吳海一

(山東省海洋科學研究院 海洋食品與醫藥研究中心，山東 青島 266104)

水蛭，別名馬蛭、麻黃蜞、馬蟥等，屬于蛭綱，水蛭科動物，具有很高的藥用價值。水蛭分布于世界各地，共有300多種，在我國有100余種。其中寬體金線蛭、茶色蛭及日本醫蛭干燥的動物全體被《中華人民共和國藥典》認定為中藥藥材[1]。水蛭在我國分布范圍很廣，在內陸淡水水域內生長繁殖，棲息于水田、溝渠中，吸食人、畜血液，是中國傳統的特種藥用水生動物。其干制品具有止痛、活血通經等功效，可用于治療產后腹痛、高血壓、中風偏癱、肝損傷、腎病綜合征等。另外活水蛭外用能吸血消腫，可用于治療癰腫、丹毒等證。近年來由于農藥、化肥等濫用，加之養殖戶對水質綜合調控的重視程度不夠，致使水蛭生活環境逐漸惡化，各類病害頻繁爆發，給水蛭養殖業造成了巨大損失。

2022年10月，山東某水蛭養殖場暴發病情，患病水蛭食欲不振，懶于活動，身體收縮，解剖可見內臟中有氣泡。本研究從瀕死的患病水蛭體內通過分離純化獲得一株優勢菌株，并利用生理生化、分子生物學、Biolog微生物鑒定系統對該菌進行鑒定，旨在為生產中水蛭的疾病防治提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

TSA胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(購自青島海博生物有限公司)用于細菌培養；生理生化鑒定管(購自杭州微生物試劑有限公司)用于細菌的生理生化分析；細菌快速鑒定板(購自美國Biolog公司)用于Biolog鑒定；細菌DNA提取和PCR試劑盒(Takara)用于模板提取及擴增，其他化學試劑和引物均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 優勢菌株分離純化 挑取患病的水蛭內臟組織，在TSA培養基上劃線，28 ℃過夜培養，挑取優勢菌落繼續轉接至純培養，置于超低溫冰箱(-80 ℃)中凍存備用。

1.2.2 菌落形態及理化特性檢測 28 ℃下培養，觀察菌落形態特征；將細菌進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌形態；預先測定菌液濃度，將適量細菌接種于生理生化鑒定管中，過夜培養后觀察結果。

1.2.3 Biolog分析 將供試菌株接入GenIII 第三代鑒定板，96孔板分布有陽性、陰性對照以及71種碳源、23化學敏感物質，培養24 h后通過Biolog微生物鑒定軟件對測試板上的“表型指紋”進行分析。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析和系統發育樹的構建 利用廣譜型基因組DNA小量提取試劑盒(TaKaRa)提取細菌DNA作為PCR反應模板。通用引物27F和1 492R作為16S rRNA 基因PCR擴增引物。50 μL PCR反應體系包含：DNA模板1 μL，引物( 10 μmol/L) 各2 μL，PremixTaqTM ( Ex TaqTM Version 2.0 plus dye) 25 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃復性1 min，72 ℃延伸l min 30 s，30個循環；72 ℃溫育10 min。吸取6 μL的PCR產物，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳20 min，利用凝膠成像儀觀察。參考陸夢瑩等[2]的方法，PCR產物送至上海生工生物有限公司測序，測序結果登陸GenBank進行BLAST比對，使用MEGA 4.0軟件，采用鄰接法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 患病水蛭優勢菌的分離純化

從患病水蛭的病灶處，分離獲得一株大小、形態、顏色一致的優勢菌，命名為SZ-1，該菌在TSA 平板上生長菌落形態為圓形、磚紅色、邊緣不光滑。革蘭氏染色鏡檢顯示，該菌為革蘭氏陰性菌，桿狀，兩端鈍圓，有極生鞭毛。

2.2 菌株SZ-1生理生化特征及Biolog分析

菌株SZ-1在生理生化管中的生長情況顯示：該菌能液化明膠，葡萄糖發酵、蔗糖發酵、乳糖發酵均為陽性；甲基紅試驗、檸檬酸鹽發酵、接觸酶反應均為陽性；乙醇、L-鼠李糖利用為陰性；水解淀粉、脂酶反應陰性。根據《伯杰氏系統細菌學手冊( 第八版) 》[3]，各項指標經對比，與假單胞菌屬相近。

通過Biolog GenIII第三代鑒定板檢測發現，系統鑒定該菌株為熒光假單胞菌B(PseudomonasfluorescensB)，相似度(SIM )為0.541，位距(DIST)為4.439。測試板上的“表型指紋”分析結果如表1所示。

表1 菌株SZ-1 Biolog 鑒定板分析結果

2.3 16S rRNA基因序列分析與系統發育樹構建

菌株SZ-1的16S rRNA 基因序列長度為1 443 bp，其序列通過NCBI-BLAST進行同源性檢索顯示其與熒光假單胞菌標準菌株MH304226.1的16S rRNA基因序列同源性最高，一致性達99.86%。從Genebank上選取典型的序列，包括熒光假單胞菌、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、燦爛弧菌(V.splendidus)、需鈉弧菌(V.natriegens)、地中海弧菌(V.mediterranei)、歐式弧菌(V.owensii)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)的16S rRNA 基因序列，利用MEGA 4.0軟件進行系統發育學分析，結果顯示細菌SZ-1與熒光假單胞菌(MH304226.1和MG576170.1)聚合在一起(如圖1所示)。

根據細菌SZ-1的生理生化特征、Biolog分析、16S rRNA基因序列分析以及系統發育樹的構建，將細菌SZ-1鑒定為熒光假單胞菌。

注：分支上的數字表示這一分支的可靠程度；長度表示進化距離。

3 討論

假單胞菌屬(Pseudomonas)廣泛分布于土壤、淡水、海水以及生物體中，是一類生長適應能力較強的革蘭氏陰性菌，大多不致病，還有一部分是條件致病菌。在水產養殖業中，熒光假單胞菌是一類常見的水生生物條件致病菌，因感染熒光假單胞菌而引發各種細菌性疾病的情況越來越普遍，該菌能感染無脊椎動物和脊椎動物，對魚蝦的危害尤其嚴重[4-5]。徐國成等[6]發現熒光假單胞桿菌感染對蝦后引起熒光病，蝦苗出現活力下降，食欲不振，直至死亡。王高學等[7]發現大鯢感染該菌會患赤皮癥，體表呈現出化膿性潰瘍并且布滿紅斑塊。中國常見的水產養殖魚類中，熒光假單胞菌能夠引起草魚、鯉和大菱鲆等發生赤皮病[5]，但是目前還未有該菌引起水蛭患病的報道。

致病性熒光假單胞菌對水產動物的危害日益嚴重，且有研究表明它可能是一種潛在的人畜共患病原，能夠引起菌血癥、皮膚病、消化系統和呼吸道感染等疾病的爆發[8]，這警示人們應該對該菌引起重視。

本研究中通過細菌形態學特征、生理生化結果初步鑒定SZ-1菌株屬于假單胞菌屬。Biolog GenIII微孔板可對細菌進行71種碳源利用測試以及23 種化學敏感性測試，其“表型指紋”被用來在種水平上鑒定該微生物，本研究中Biolog GenIII分析鑒定該菌株為熒光假單胞菌。細菌SZ-1的16S rRNA 基因序列分析及系統發育樹構建，顯示該菌的16S rRNA基因序列與已報道的熒光假單胞菌(MH304226.1和MG576170.1) 16S rRNA基因序列的相似性高達99%以上，構建的系統發育樹也表明，SZ-1菌株與熒光假單胞菌聚為一支。

綜上所述，本研究中利用微生物學和分子生物學方法，對患病水蛭進行了病原菌的分離和鑒定，研究結果可為水蛭養殖過程中熒光假單胞菌的疾病防治提供基礎資料。