響應(yīng)面法優(yōu)化姜黃油脂質(zhì)體制備工藝及性能的研究

董雪容， 孟雨薇， 周 軍,2， 李湘洲,2

(中南林業(yè)科技大學材料科學與工程學院1，長沙 410004) (中南林業(yè)科技大學 天然產(chǎn)物加工利用研究所2，長沙 410004)

姜黃，姜科的一種，來自于印度和南亞的原生植物，目前已經(jīng)在世界范圍內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，并被廣泛地用作香料，賦予食物特有的風味和顏色，國際糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織都已承認其安全性[1]。在中國，姜黃作為一味中藥已被使用1 000多年。姜黃碩大的根莖中含有的姜黃素和姜黃油等活性成分，使其具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、平喘和鎮(zhèn)痛等藥理作用，最新研究表明，姜黃甚至可以通過抑制主要蛋白酶的表達而對COVID-2019病毒具有潛在抑制效果[2-4]。工業(yè)上姜黃主要用于提制姜黃素，而作為加工副產(chǎn)物的姜黃油因含有芳姜黃酮和α-姜黃烯等豐富的單萜、倍半萜和芳香族化合物，具有較強的抗氧化、抗炎和抗菌活性，已少量應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域，但因其水溶性差、易揮發(fā)、生物利用度低、味辛辣且刺激等，姜黃油的深度開發(fā)與利用受限。

近年來，新型載體系統(tǒng)對改善揮發(fā)油的天然缺陷方面的研究與應(yīng)用越來越多，如包合物[5]、納米乳[6]、微膠囊[7]和脂質(zhì)體等。脂質(zhì)體是植物精油微膠囊化最有效的方法之一，對提高精油生物利用度、保護精油和實現(xiàn)精油緩釋、控釋[8]具有重要作用。脂質(zhì)體也稱為脂囊泡或囊泡，是由一個或幾個脂質(zhì)(通常是天然和合成磷脂)雙層包裹組成的微觀球形結(jié)構(gòu)[9]。脂質(zhì)體制備方法包括薄膜分散法[10]、有機溶劑注入法[11]、逆向蒸發(fā)法[12]、反復(fù)凍融法[13]等。薄膜分散法制備的脂質(zhì)體為多層脂質(zhì)體(MLV)，其包裹脂溶性藥物的能力優(yōu)越，幾乎可以實現(xiàn)全部封裝[14]。為了降低制備的脂質(zhì)體粒徑，常結(jié)合其他的分散方法，如超聲、擠壓等。 目前關(guān)于薄膜分散法超聲波法制備姜黃油脂質(zhì)體的研究鮮見報道。

本研究利用薄膜分散超聲波法制備姜黃油脂質(zhì)體，響應(yīng)面法制備姜黃油脂質(zhì)體的工藝，并對脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)特征、儲藏穩(wěn)定性、釋放性能及抑菌活性進行表征，有利于姜黃油在食品、藥品等領(lǐng)域的深度開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干姜黃，市購。單核細胞增生李斯特菌(ATCC 19114)、大豆卵磷脂(純度>70%)、膽固醇(純度99%)。牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉，均為BR。

1.2 儀器與設(shè)備

ZS90馬爾文納米粒度儀，JEM-1400plus透射電子顯微鏡，PHSJ-4FpH酸度計，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵，R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，UV2310 Ⅱ紫外可見分光光度計，SHA-B水浴恒溫振蕩器，GH隔水式恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 姜黃油的提取

采取水蒸氣蒸餾法從姜黃中提取姜黃油。將干姜黃粉碎后稱取70 g，置于1 L圓底燒瓶中，加入700 mL蒸餾水，連接精油提取器，加熱至微沸，提取數(shù)小時后得到姜黃油，加入無水硫酸鈉去除水分，得到黃色油狀的純姜黃油，4 ℃儲藏，備用。

1.3.2 姜黃油脂質(zhì)體的制備

采取薄膜分散超聲波法[15]。稱取一定比例的卵磷脂和膽固醇，加入一定量的精油于圓底燒瓶中，再加入10 mL無水乙醇，超聲一定時間直至溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(30 ℃，30 r/min)上蒸發(fā)分散，形成透明脂質(zhì)薄膜。再加入10 mL PBS溶液(pH=7.2)恒溫超聲一定時間，靜置精油脂質(zhì)體，利用上述方法制備不加精油的空白脂質(zhì)體。

1.3.3 姜黃油標準曲線繪制

配制姜黃油-無水乙醇溶液，以無水乙醇為參比，紫外分光光度計上200～600 nm范圍進行掃描，測得姜黃油紫外最大吸收峰波長為236 nm。精密吸取50 μL姜黃油置于50 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容，得到1 μL/mL的濃溶液。配制成姜黃油體積分數(shù)分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 μL/mL的標準品溶液，分別在236 nm條件下測定不同濃度姜黃油標準溶液的吸光度值A(chǔ)，以標準溶液濃度C為橫坐標、吸光值A(chǔ)為縱坐標繪制并獲得標準曲線為A=38.462C+0.246 6，R2=0.998 5，此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.4 姜黃油包封率的測定

采用有機溶劑萃取法測定姜黃油脂質(zhì)體的包封率[16]。將姜黃油脂質(zhì)體懸液倒入試管中，加入3 mL正己烷，充分混合后，靜置1 h，收集的上層有機溶液，反復(fù)萃取3次后合并有機相，用無水乙醇定容至 25 mL，測定表層未包封的姜黃油量。姜黃油脂質(zhì)體包封率的計算方法見式(1)。

EE=(V0-V1)/V0×100%

(1)

式中：EE為姜黃油脂質(zhì)體包封率/%；V0為加入的姜黃油量/mL；V1為未包封的姜黃油量/mL。

1.3.5 單因素實驗設(shè)計

分別考察姜黃油體積分數(shù)(姜黃油與無水乙醇的體積百分比)、大豆卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比、超聲功率和超聲時間對姜黃油包封率的影響。在大豆卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比5∶1，超聲時間10 min，超聲功率420 W的條件下，分別考察姜黃油體積分數(shù)為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%對姜黃油脂質(zhì)體包封率的影響。在體積分數(shù)1%，超聲時間10 min，超聲功率420 W的條件下，分別考察大豆卵磷脂和膽固醇比1∶0、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1對姜黃油脂質(zhì)體包封率的影響。在體積分數(shù)1%，大豆卵磷脂和膽固醇比4∶1，超聲功率420 W的條件下，分別考察超聲時間10、20、30、40、50 min對姜黃油脂質(zhì)體包封率的影響。在體積分數(shù)1%，大豆卵磷脂和膽固醇比4∶1，超聲時間30 min的條件下，分別考察超聲功率280、350、420、490、560 W對姜黃油脂質(zhì)體包封率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取姜黃油體積分數(shù)(A)、大豆卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比(B)、超聲時間(C)為考察因素，采用Box-Behnken設(shè)計對姜黃油脂質(zhì)體的制備工藝進行優(yōu)化。實驗因素及編碼見表1。

表1 實驗因素水平及編碼

1.3.7 形貌結(jié)構(gòu)表征

將測試用銅網(wǎng)浸沒于姜黃油脂質(zhì)體中，2 min后取出銅網(wǎng)，去除表面多余的脂質(zhì)體，自然風干，用2%的磷鎢酸染色5 min，去除多余的染液，自然風干后進行透射電鏡分析。

1.3.8 PDI和粒徑分析

將樣品經(jīng)適當稀釋后，采用馬爾文納米粒度儀測定其PDI和粒徑，每個樣品平行測定3次。

1.3.9 儲存穩(wěn)定性分析

取2組姜黃油脂質(zhì)體，分別置于4 ℃的恒溫冰箱和25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，并于第1、2、3、4、5、6、7、14 d時取樣，利用pH計測定待測樣的pH值。

1.3.10 釋放性能研究

根據(jù)歐盟委員會法規(guī)10/2011 EU (10/2011/EC)[17]，選取食品模擬介質(zhì)10%乙醇，50%乙醇作為釋放介質(zhì)，研究姜黃油脂質(zhì)體的釋放性能。移取等量脂質(zhì)體懸液于透析袋(14 ku)中，分別置于10%乙醇和50%乙醇中37 ℃恒溫振蕩，分別于第1、2、3、4、5、6、8、10、12 h移取3 mL釋放液，并補充等量新鮮釋放介質(zhì)。釋放液于236 nm下測定吸光度，計算姜黃油累積釋放量。分別用零級釋放動力學方程、一級釋放動力學方程、Higuchi 方程、Ritger-peppas對體外釋放結(jié)果進行釋放動力學擬合。

1.3.11 姜黃油脂質(zhì)體對單增李斯特菌的抑菌性能研究

利用平板菌落計數(shù)法測定姜黃油脂質(zhì)體的抑菌性能。將單增李斯特菌活化，添加3 mL姜黃油脂質(zhì)體至單增李斯特菌PBS(pH=7.2)菌懸液中，體積分數(shù)30%，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，分別于第0、1、2、3、4天進行平板涂布計數(shù)，觀察單增李斯特菌菌落變化情況。

1.3.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用IBM SPSS Statistics22軟件做單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05，具有顯著性差異；Origin 2018進行相關(guān)圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對制備的姜黃油脂質(zhì)體中姜黃油包封率的影響

分別研究了姜黃油體積分數(shù)、大豆卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比、超聲時間和超聲功率對制備的姜黃油脂質(zhì)體中姜黃油包封率的影響，實驗結(jié)果和圖1所示。

圖1 各因素對包封率的影響

由圖1可知，隨著姜黃油體積分數(shù)的增大，包封率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當姜黃油體積分數(shù)為1%時，包封率達到最大值為83.65%。姜黃油過量會超過脂質(zhì)膜的包封能力，導(dǎo)致包封率下降，故宜選擇姜黃油體積分數(shù)為1%。隨著卵磷脂和膽固醇配方中卵磷脂比例的增加，包封率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在4∶1時包封率達到最大值為85.2%。大豆卵磷脂是脂質(zhì)體的主要成分，膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動性和穩(wěn)定性的功能。當大豆卵磷脂量少時脂質(zhì)體膜不易形成，而當膽固醇含量低時膜易流動且不穩(wěn)定，導(dǎo)致精油泄漏[18]。因此，宜選擇大豆卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比為4∶1。隨著超聲時間的增加，包封率呈先上升后下降的趨勢，當超聲時間為30 min時，包封率達到最大值為92.35%。超聲時間過長會引發(fā)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致精油泄漏，而時間過短時，脂質(zhì)體粒徑分布不均勻，體系不穩(wěn)定[19]。因此，宜選擇超聲時間為30 min。隨著超聲功率的增大，包封率呈先上升后急劇下降的趨勢，當超聲功率為420 W時，包封率達到最大值為92.35%，當功率超過420 W時，包封率下降，主要是超聲過度導(dǎo)致姜黃油脂質(zhì)體膜雙分子結(jié)構(gòu)的破壞[20]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

測定不同處理條件下的姜黃油包封率，結(jié)果見表2。利用Design Expert 10 實驗設(shè)計軟件對指標Y與影響因素間的關(guān)系進行多元回歸分析，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken設(shè)計表及效應(yīng)值

表3 響應(yīng)面回歸分析結(jié)果

由表3可知，預(yù)測模型的P值小于0.05，說明模型顯著；失擬項的P值大于0.05，說明模型對真實情況的模擬是準確的，表明該預(yù)測模型可以用于姜黃油脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化。擬合得到的多元二次方程式為：

Y=90.52+2.31A-1.46B-1.88C+6.55AB-1.87AC-1.83BC-0.14A2-1.19B2-1.01C2

最佳制備工藝條件為姜黃油體積分數(shù)1.2%，卵磷脂和膽固醇4.8∶1，超聲時間20.9 min，此條件下預(yù)測的最大響應(yīng)值為100%。根據(jù)實驗實際情況，選取姜黃油體積分數(shù)1.2%，卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比5∶1，超聲時間21 min進行驗證實驗，重復(fù)3次，測得制備的姜黃油脂質(zhì)體中姜黃油包封率為96%，與理論值接近，表明響應(yīng)面模型對姜黃油脂質(zhì)體的制備具有現(xiàn)實指導(dǎo)意義。

2.3 姜黃油脂質(zhì)體形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

姜黃油脂質(zhì)體的透射電鏡分析結(jié)果見圖2。姜黃油脂質(zhì)體呈均勻半透明的乳白色液體。透射電鏡下觀察可以看到姜黃油脂質(zhì)體具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)。圖3粒徑分析結(jié)果表明，空白脂質(zhì)體的平均粒徑為230 nm，而姜黃油脂質(zhì)體的平均粒徑為896 nm。姜黃油脂質(zhì)體的粒徑大于空白脂質(zhì)體，原因可能是精油插入脂質(zhì)雙分子層中，從而降低磷脂分子間的

圖2 姜黃油脂質(zhì)體及其透射電鏡分析

聚合性，引起粒徑的增大[21]。Bai等[22]報道薏仁油的裝載能力明顯會增大脂質(zhì)體的粒徑。Lin等[23]報道粒徑大小隨著菊花精油濃度的增大而增大。多分散性系數(shù)PDI分析結(jié)果表明，空白脂質(zhì)體的PDI為0.47，姜黃油脂質(zhì)體的PDI為0.44。精油脂質(zhì)體的多分散性小于空白脂質(zhì)體，說明其均勻性有所提高[24-26]。

圖3 空白脂質(zhì)體和精油脂質(zhì)體的粒徑和PDI

2.4 姜黃油脂質(zhì)體儲存穩(wěn)定性分析

脂質(zhì)體穩(wěn)定性是評價脂質(zhì)體質(zhì)量的重要指標之一。在脂質(zhì)體體系中，卵磷脂為脂質(zhì)體雙層膜主要成分，易被水解氧化成游離的脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿[27]。通過測定不同儲藏條件下的pH，可以有效反映脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4。姜黃油脂質(zhì)體分別在4 ℃和25 ℃的條件下儲存14 d，pH均接近中性，無顯著變化，說明姜黃油脂質(zhì)體在此條件下相對穩(wěn)定，未分解產(chǎn)生過多的游離脂肪酸，短時間內(nèi)在4 ℃和25 ℃下均可以儲存姜黃油脂質(zhì)體。

圖4 不同儲存條件下姜黃油脂質(zhì)體pH的變化

2.5 姜黃油脂質(zhì)體釋放性能分析

姜黃油脂質(zhì)體分別在10%乙醇和50%乙醇模擬釋放液中的釋放效果見圖5。在10%乙醇介質(zhì)中，姜黃油脂質(zhì)體中的姜黃油釋放緩慢，12 h內(nèi)的累計釋放率僅為11.7%，而在50%乙醇介質(zhì)中，姜黃油的釋放相對較快，12 h內(nèi)的累計釋放率為21.5%(P<0.001)。對不同介質(zhì)中的釋放效果分別進行零級釋放動力學、一級釋放動力學方程、Higuchi方程和Ritger-peppas方程擬合，結(jié)果見表4。在10%乙醇中，脂質(zhì)體中姜黃油的釋放機制符合Ritger-peppas方程，n=0.196 4，說明釋放過程以擴散機理為主[28](n<0.5是擴散機理，0.450.89是溶蝕機制)。姜黃油脂質(zhì)體在50%乙醇介質(zhì)中的釋放符合一級釋放動力學方程，表現(xiàn)為緩釋制劑的基本釋放特征。

圖5 姜黃油脂質(zhì)體分別在10%乙醇和50%乙醇模擬釋放液中的釋放效果

2.6 姜黃油脂質(zhì)體抑菌性能分析

前期研究表明，姜黃油對食源性致病菌單增李斯特菌的抑制效果較好，因此選取單增李斯特菌研究姜黃油脂質(zhì)體的抑菌性能，結(jié)果見圖6。單核增生李斯特菌菌懸液的初始菌數(shù)為7.5×107，在菌懸液中加入3 mL姜黃油脂質(zhì)體培養(yǎng)1 d后菌落數(shù)顯著降低(P<0.001)，且隨時間的增加，菌落數(shù)呈繼續(xù)下降的趨勢，說明姜黃油脂質(zhì)體能緩慢釋放姜黃油，并對單增李斯特菌表現(xiàn)出長效抑菌的效果。

表4 不同釋放介質(zhì)下的釋放動力學模型擬合結(jié)果

注：標有不同字母表示數(shù)據(jù)有顯著差異(P<0.05)。圖6 姜黃油脂質(zhì)體對單增李斯特菌的抑菌性能

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面優(yōu)化獲得了姜黃油脂質(zhì)體的制備工藝為姜黃油體積分數(shù)1.2%，卵磷脂和膽固醇5∶1，超聲時間21 min，此條件下制備的脂質(zhì)體中姜黃油的包封率為96%，建立的響應(yīng)面模型可靠，對姜黃油脂質(zhì)體的制備具有指導(dǎo)意義。姜黃油脂質(zhì)體具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，粒徑為896 nm，屬于大單室脂質(zhì)體(LUV)，PDI 多分散指數(shù)為0.44。分別在4 ℃和25 ℃的條件下儲存14 d，姜黃油脂質(zhì)體的穩(wěn)定性良好。10%乙醇和50%乙醇的釋放介質(zhì)中姜黃油脂質(zhì)體均具有一定的緩釋效果，且分別符合Ritger-peppas和一級釋放動力學模型。姜黃油脂質(zhì)體對單增李斯特菌具有長效的抑菌效果。

脂質(zhì)體技術(shù)可以有效提高姜黃油的穩(wěn)定性，使姜黃油緩慢釋放而達到長效抑菌的效果，拓展了姜黃油等植物精油在食品保鮮等領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用。