致瀉性大腸埃希氏菌檢驗操作要點及質量控制探究

《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）于2021年11月22日實施，該標準修改了肉制品和即食果蔬制品的致病菌指標，刪除了大腸埃希氏菌O157:H7/NM項目，新增加了致瀉大腸埃希氏菌項目[1]，引起了檢驗工作者的廣泛關注，也對該項目的檢測提出了更高的要求。本文通過對食品中致瀉大腸埃希氏菌檢驗原理進行解讀，對檢驗操作要點進行總結歸納，對質量控制要求進行探討，為致瀉大腸埃希氏菌的檢驗工作提供參考。

1 致瀉大腸埃希氏菌概述

1.1 簡介

致瀉大腸埃希氏菌是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的大腸埃希氏菌。致瀉大腸埃希氏菌分為5種，包括腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產腸毒素大腸埃希氏菌、產志賀毒素大腸埃希氏菌和腸道集聚性大腸埃希氏菌。

1.2 污染源

致瀉大腸埃希氏菌常見的污染食品為生禽畜肉、熟肉制品、水產品、蔬菜以及水果等[2]。致瀉大腸埃希氏菌可通過污染水源或土壤，進而污染食品。

1.3 致瀉大腸埃希氏菌與大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希菌的區別

大腸菌群，是指在36 ℃培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭陰性無芽孢桿菌，包括埃希菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸菌屬和克雷伯菌屬等；糞大腸菌群，又稱耐熱大腸菌群，是一群在44.5 ℃條件下培養24～48 h能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭陰性無芽孢桿菌，主要由大腸埃希菌組成，還包括與糞便污染無直接相關性的其他菌株，如肺炎克雷伯菌；大腸埃希菌隸屬腸桿菌科埃希菌屬，其廣泛存在于人和溫血動物的腸道中，是革蘭陰性無芽孢桿菌，能夠在44.5 ℃發酵乳糖產酸產氣，IMVC生化試驗結果為“++--”或“-+--”；致瀉大腸埃希氏菌是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的大腸埃希菌。

2 檢驗操作要點

2.1 檢驗標準及限量要求

食品中致瀉大腸埃希氏菌的檢驗執行《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》（GB 4789.6—2016）[3]?！妒称钒踩珖覙藴?預包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）標準中，對肉制品和即食果蔬制品的致瀉大腸埃希氏菌進行了限量規定?！鄂r、凍四分體牛肉》（GB/T 9960—2008）、《鮮凍胴體羊肉》（GB/T 9961—2008）等標準中也規定了需對致瀉大腸埃希氏菌進行檢驗。

2.2 檢驗步驟及流程解讀

致瀉大腸埃希氏菌的檢驗流程可概括為樣品處理→營養肉湯進行預增菌培養→腸道菌增菌肉湯中進行增菌培養→麥康凱瓊脂（MAC）和伊紅美藍瓊脂（EMB）進行分離→對典型或可疑菌落進行生化鑒定→取生化反應符合特征的菌落進行PCR確認試驗和血清學試驗（選做）→報告每25 g樣品中是否檢出致瀉大腸埃希氏菌，并報告樣品中檢出的某類致瀉大腸埃希氏菌的血清型別。

2.3 操作注意事項

①樣品為帶骨肉制品時，取可食用部位（肌肉或組織）。對易產生較大顆粒的樣品（如肉類）進行檢測時，建議使用帶濾網均質袋，以便均質后用吸管吸取勻液。②取前增菌液接種腸道菌增菌肉湯后，需在（42±1）℃溫度下進行培養，該溫度范圍內培養有助于抑制非腸道菌生長。③分離劃線用直徑3 mm的接種環（1環約10 μL）；可疑菌落的選取應是每個瓊脂平板上分別取10～20個（10個以下的全選）乳糖發酵和不發酵的菌落；生化試驗和PCR確認試驗均應挑取單個可疑菌落的純培養物。為保證結果的準確性，必要時可進行二次純化。④在培養箱中，為了防止中間培養皿過熱，平板的疊放高度不宜超過6個培養皿。⑤在三糖鐵試驗時，要保證三糖鐵瓊脂斜面部分和管下部瓊脂的長度，一般要求瓊脂底部和斜面最低點的距離應不少于4 cm，穿刺時宜穿刺至培養基底部3～5 mm處；在三糖鐵瓊脂培養時，應將試管口松開，保持管內有充足的氧氣，否則由于氧氣不足，斜面酸性產物不能氧化恢復紅色，而影響結果的判斷。⑥在氰化鉀試驗時，由于氰化鉀是劇毒藥品，應注意小心操作，切勿沾染。⑦增菌后的所有操作均應在生物安全二級實驗室進行，操作時應有防污染的措施；在進行可能產生氣溶膠的操作時，均應在生物安全柜內完成。⑧在血清學試驗時，首先要進行菌體的自凝性檢查。大腸埃希氏菌H抗原在傳代中容易丟失或發育不良，需在半固體上傳代3次，觀察生長情況。如不擴散，則表示H抗原丟失，無法做H抗原凝集試驗。⑨按照標準要求，需要先對可疑菌落進行生化鑒定，生化鑒定為大腸埃希氏菌后，再進行毒力基因的檢測，判定致瀉大腸埃希氏菌的種類。因為在腸桿菌科中，一些致病菌也存在相同的毒力基因，所以不能對可疑菌落直接進行毒力基因檢測來判定致瀉大腸埃希氏菌的種類。⑩一般情況下，根據特征毒力基因檢測結果可確認樣品中致瀉大腸埃希菌的型別，不需要進行血清學試驗。在食源性疾病暴發溯源調查時，血清學分型簡便易行。在確定了致瀉大腸埃希菌型別后，可以快速對不同來源菌株的同源性進行初步判斷，利于溯源調查。

3 質量控制要求

在食品微生物檢驗過程中，為保證檢驗結果的可靠性，必須使用經驗證的檢測方法，嚴格按照食品微生物實驗室質量管理要求進行檢驗[4]。

3.1 人員要求

①微生物實驗人員應掌握微生物檢驗方面的基礎操作，如培養基制備、消毒滅菌、無菌操作、倒平板和菌種傳代等。經考核合格后持證上崗，并制定繼續教育計劃，不斷更新知識和技能。②檢驗人員必須熟悉檢驗標準、檢驗程序、方法和結果評價。③檢驗人員應經過實驗室生物安全方面的培訓，熟悉生物安全操作知識和消毒滅菌知識，保證自身安全，防止污染擴散。

3.2 環境控制要求

①PCR確認試驗的試驗環境和試驗操作應符合食品分子生物學檢測的要求，注意預防污染。使用和處理有毒有害物質時，注意實驗人員的安全防護和對環境的保護。②為了控制環境污染，每次檢驗過程中，于檢驗臺上打開兩塊平板計數瓊脂平板，并在檢驗環境中暴露不少于15 min，將此平板與本批次樣品同時進行培養，以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環境的污染。③定期對生物安全實驗室和生物安全柜進行潔凈度監測，監測項目包括懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、溫濕度和照度等。

3.3 設備、設施要求

①檢驗中所用設備必須是經過檢定的設備。檢驗所用耗材，如吸管、培養基、平皿必須完全滅菌。重復使用的耗材應徹底清洗干凈，不得殘留抑菌物質。②非簡單壓力容器操作人員需持特種作業人員上崗證。高壓蒸汽滅菌器，應用化學指示膠帶、指示卡或生物指示劑，驗證滅菌效果。③監測恒溫培養箱溫度是否恒定，溫度變化不可超過±1 ℃。建議安裝溫度監控系統，對恒溫培養箱的溫度進行實時監控。④對于一些容易污染微生物的儀器設備，如培養箱、水浴鍋、冰箱、生物安全柜和層流超凈工作臺等，定期進行清潔、消毒。

3.4 培養基、試劑要求

①實驗過程中使用的培養基和試劑按照GB 4789.28—2013的規定進行驗收和性能測試，做好記錄。不應使用結塊、顏色發生變化或其他物理性狀發生改變的脫水培養基。②培養基溶解和滅菌后分別測定pH值，以保證細菌培養所需pH值符合要求。配制好的培養基應標明配制日期，不宜放置過久。采用經驗證的滅菌程序滅菌；已滅菌的培養基可在4～10 ℃存放7 d，存放時應避免陽光直射、液體蒸發和雜菌侵入；當液體顏色變化、體積變化時，應廢棄、不用。③檢測試劑盒和診斷血清驗收時注意查看批號、有效期、血清效價、透明度與色澤，及時冷藏（2～8 ℃）儲存。使用過程中，盡量縮短脫離冷藏環境的時間。

3.5 內外部質量控制

①實驗過程中要做空白對照，如果空白對照板上出現菌落時，應廢棄本次實驗結果，并從實驗環境、培養基、平皿和吸管等方面分析污染來源。②每次進行PCR檢測時應使用腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產腸毒素大腸埃希氏菌、產志賀毒素大腸埃希氏菌/腸出血性大腸桿菌、腸道集聚性大腸埃希氏菌標準菌株作為陽性對照。同時使用大腸埃希氏菌ATCC 25922或等效標準菌株作為陰性對照，以滅菌去離子水為空白對照，控制PCR污染體系。腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產腸毒素大腸埃希氏菌、產志賀毒素大腸埃希氏菌/腸出血性大腸桿菌、腸道集聚性大腸埃希氏菌標準菌株應從專業微生物保藏機構、同行認可的專業權威機構或有資質的商業派生菌株生產廠家等認可的途徑獲得，菌株經過驗證后使用。CICC 10667、CICC 24186、CICC 24188和CICC 24189分別屬于產腸毒素大腸埃希氏菌、腸道集聚性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌和腸道致病性大腸埃希氏菌。CICC 10670和CICC 24187屬于腸道出血性大腸埃希氏菌[5]。③定期使用致瀉大腸埃希氏菌標準菌株或相應定量活菌參考品，在陽性對照實驗室內，用適當的食品樣品進行陽性試驗驗證，染菌量應控制在每25 g樣品中含10～100 CFU活菌，并進行記錄，質控頻次至少每兩個月進行1次。④通過參加該項目實驗室間比對或能力驗證，進行質量評估，及時發現自身存在的問題和與其他實驗室間的差距。

4 結語

食品微生物檢驗受諸多因素的影響，如樣品中微生物分布的不均勻性、環境帶來的污染、培養基和試劑的質量不符合要求和人員操作帶來的偏差等。生產企業和檢驗機構的檢測人員在進行致瀉大腸埃希氏菌檢驗時，應嚴格按照標準規定的檢驗程序操作，掌握操作要點和注意事項，從人、機、料、法和環等方面進行質量控制，確保檢測結果準確、可靠。