采用CRISPR/Cas系統的基因編輯技術在腎臟疾病研究中的應用進展

羅楚漩 何強

基因編輯是一種利用細菌核酸酶有效準確地修改生物體基因組特定目標基因，研究基因功能、構建疾病模型以及治療特定疾病的新型基因工程技術[1-2]。目前常用的基因編輯技術主要包括鋅指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFN）、轉錄激活樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases,TALEN）以及規(guī)律成簇間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/CRISPR相關蛋白質（CRISPR-associated proteins,Cas）系統。然而，昂貴、費時、剪切效率低等缺陷限制了前兩種技術在生命科學研究領域中的廣泛應用。CRISPR/Cas系統是一種由細菌或古生菌的適應性免疫系統發(fā)展而來的第三代基因組定點編輯技術，能夠快速有效地對基因組內特定的DNA序列進行編輯。由于其操作簡單、效率高、特異性強、應用多樣等諸多優(yōu)點，已成為目前最受研究人員歡迎的基因編輯技術。隨著CRISPR/Cas系統的出現，人類基因組研究發(fā)生了革命性的變化，人們能夠更好地理解單個基因產物對生物體疾病的貢獻。

已知許多腎臟疾病的發(fā)病機制與遺傳因素密切相關，研究發(fā)現高達15%的病例直接源自孟德爾突變，而更多的病例可能涉及更為復雜的遺傳模式[3]。雖然許多導致腎臟疾病的基因已經被確認，但還需要功能性實驗來驗證遺傳學研究中產生的候選基因，并確定突變如何在細胞和組織水平上導致疾病。此外，還有許多未知的與腎臟疾病相關的基因等待研究人員進一步探索。CRISPR/Cas系統使人們能夠進行有針對性的實驗來解決這些問題，更加深入地理解腎臟疾病的病理生理學，因此越來越多地被應用于腎臟疾病的研究。本文主要從CRISPR/Cas系統的發(fā)現、基本原理、分類及其在腎臟疾病研究中的應用進展等方面作一綜述，旨在為今后應用該基因編輯技術進行相關研究提供參考。

1 CRISPR/Cas系統概述

1.1 CRISPR/Cas系統的發(fā)現 CRISPR/Cas系統的發(fā)現最早可以追溯到1987年，Ishino等[4]首次報道在革蘭陰性桿菌中發(fā)現負責堿性磷酸酶同工酶轉化的iap基因中存在一段特殊的串聯間隔重復序列，且該序列在多種細胞功能中均發(fā)揮著重要的作用。隨后，人們相繼在革蘭陽性菌、古生菌中也發(fā)現了相似序列[5]。2002年Jansen等[6]正式將其命名為CRISPR，并在含有CRISPR的原核生物中發(fā)現了4個Cas基因。2005年Bolotin等[7]研究發(fā)現，間隔區(qū)基因與噬菌體已知基因之間存在一定的同源性，提示CRISPR/Cas系統可能是一種獲得性的免疫防御系統。2007年CRISPR/Cas系統被進一步證實為原核生物的一種DNA修復機制，即病毒入侵后，細菌整合了噬菌體基因組序列的新間隔，通過去除或添加特定的間隔修飾細胞的噬菌體抗性表型[8]。2013年科學家們首次將CRISPR/Cas技術應用于人類細胞和小鼠細胞的基因組編輯[9-10]。2020年四川大學盧鈾教授團隊報道了全球首個采用CRISPR/Cas系統基因編輯人體臨床試驗，為該技術進一步向臨床研究轉化提供了重要依據[11]。CRISPR/Cas系統的發(fā)現為基因組學研究開辟了一條新途徑，對遺傳疾病和生物工程的應用產生了重要的影響。

1.2 CRISPR/Cas系統的基本原理 CRISPR/Cas系統通過引導核酸酶結合和剪切特定的核酸序列，為微生物提供針對外源基因元件的RNA引導的適應性免疫。雖然CRISPR/Cas系統的詳細作用機制目前尚未完全闡明，但該系統發(fā)揮作用大致包括以下3個過程：第1個過程為適應，微生物捕獲外源基因片段，并將外源DNA或RNA片段整合進基因組CRISPR序列；第2個過程為表達，將該外源片段轉錄成RNA，即CRISPR RNA（crRNA）；第三個過程為干預，在crRNA引導下，通過RNA-RNA或RNA-DNA配對，Cas蛋白作用于外源入侵DNA使其降解[12]。

1.3 CRISPR/Cas系統的分類 2011年Makarova等[13]將CRISPR/Cas系統分為3種類型和未分類的系統。Ⅰ型CRISPR/Cas系統主要包含Cas3基因。該基因不僅編碼具有解旋酶和DNA酶活性的蛋白質，而且編碼包含不同組分的級聯復合物[14]。Ⅱ型CRISPR/Cas系統只存在于細菌中，該系統中的特征基因Cas9被證實能夠產生crRNA和切割目標DNA。Ⅲ型CRISPR/Cas系統常見于古生菌中，該系統的特征基因Cas10能夠編碼一種結構域與核酸聚合酶和核酸環(huán)化酶結構域同源的蛋白[15]。

近年來，隨著對CRISPR/Cas系統認識的不斷深入，2015年Makarova等[16]對CRISPR/Cas系統進行重新分類。根據干預階段參與蛋白，新的分類將CRISPR/Cas系統分為2大類，需要多個蛋白協同作用被分為1類系統，只需要一個蛋白參與的被分為2類系統。由于2類CRISPR/Cas系統組分較為簡單，該系統成為目前研究最多、應用較為廣泛的系統。

2 CRISPR/Cas系統在腎臟疾病研究中的應用

2.1 CRISPR/Cas系統在研究腎臟疾病治療靶點中的應用

2.1.1 腎間質纖維化 腎間質纖維化是各種病因導致的慢性腎臟病不斷進展的共同最終途徑，以細胞外基質的過度生成和沉積為主要特征，被認為是導致腎功能損害的常見原因之一[17]。然而目前腎間質纖維化的發(fā)病機制尚未完全闡明。CRISPR/Cas系統為腎間質纖維化發(fā)病機制研究提供了新手段。大量研究結果表明，轉化生長因子 β（transforming growth factor β,TGF-β）在組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[18]。然而，抑制TGF-β預防纖維化的同時也會破壞其抗炎和創(chuàng)面愈合作用[19]。因此，如何平衡這兩種相反的作用成為一個主要的臨床難題。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是大多數TGF-β信號通路中常見的輔助因子。既往有研究表明，β-catenin與T細胞因子（T-cell factor,TCF）結合時可激活促纖維化基因，而與叉頭轉錄因子（forkhead transcription factor O,FoxO）結合則促進細胞在氧化應激下的存活。2019年Rao等[20]采用CRISPR/Cas系統特異性敲除小鼠腎小管上皮細胞中的FoxO1或TCF1，證實了FoxO1可以抵抗TGF-β誘導的促纖維化蛋白表達，而TCF小分子抑制劑可預防單側輸尿管梗阻腎纖維化。該研究結果揭示了FoxO是腎間質纖維化的潛在治療靶點。

2.1.2 急性腎損傷 急性腎損傷是一種以腎功能迅速下降、氮質血癥、少尿或無尿為主要特征的綜合征[21]。既往有研究表明，Klotho可防止腎臟損傷，該基因在衰老和急性腎損傷后表達減少[22-23]。IL-10是一種抗炎細胞因子，可改善順鉑治療后的腎損傷[24-25]。大多數CRISPR/Cas系統發(fā)揮基因編輯作用主要依賴于誘導DNA雙鏈的斷裂，但DNA雙鏈斷裂引起的不必要的突變可能會帶來有害的影響，因此影響了它們在臨床治療中的應用。科學家們開發(fā)了一種新型的Cas9蛋白，這種蛋白不僅能結合到基因組上的特點位置，而且不會造成雙鏈DNA的斷裂[26]。這些Cas9蛋白和另一些能影響基因表達的分子開關蛋白融合在一起，能起到轉錄調控蛋白的作用，從而定點啟動特定的基因。腺相關病毒（adeno-associated virus,AAV）是一類結構簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，目前被認為是一種相對安全的基因轉移載體，可以感染多種類型的細胞，包括分裂和非分裂細胞，在臨床前研究中展現出了極大的前途[27]。2017年Liao等[28]利用不同的AVV載體分批把Cas9蛋白、分子開關、Klotho和IL-10的向導RNA（guide RNA,gRNA)遞送到細胞內，觀察到不僅這些基因表達的蛋白水平增加，而且還會改善急性腎損傷發(fā)生后的腎臟功能，該研究為開發(fā)針對急性腎損傷的表觀遺傳療法開辟了新途徑。

2.2 CRISPR/Cas系統在構建腎臟疾病模型中的應用

2.2.1 常染色體顯性多囊腎病 常染色體顯性多囊腎病（autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD）是一種常見的遺傳性腎臟病，以腎臟體積增大、高血壓和各種腎外并發(fā)癥為主要臨床表現[29]。據估計，全球有大約600萬ADPKD患者，其中超過一半的患者會發(fā)展為終末期腎臟病，并且需要透析或腎移植[30]。然而，目前尚缺乏治療ADPKD的有效藥物。ADPKD藥物的開發(fā)依賴于疾病動物模型進行藥物藥效及藥理篩選。隨著CRISPR/Cas系統的迅速發(fā)展，該技術已被廣泛應用于構建疾病動物模型領域，成為研究相應疾病的有效策略，為解決臨床問題提供了良好的工具。大部分ADPKD主要由PKD1基因突變引起。2019年Tsukiyama等[31]運用CRISPR/Cas系統成功構建了敲除PKD1基因的恒河猴模型，該實驗動物腎臟表現為體積增大伴大量囊腫形成，證明敲除PKD1基因可成功模擬ADPKD患者腎臟。2020年Kuraoka等[32]將CRISPR/Cas系統應用于人誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）。研究者敲除人iPSC細胞中的PKD1基因，并誘導細胞向腎單位前體細胞和輸尿管芽分化，同樣成功地構建了ADPKD模型。上述模型為闡明ADPKD的發(fā)病機制，探索有效的治療策略，奠定了良好的基礎。

2.2.2 法布里病 法布里病又稱Anderson-Fabry病，最早由兩位皮膚科醫(yī)生William Anderson和Johannes Fabry報道，由此得名，是一種罕見的X伴性遺傳的溶酶體貯積病，由編碼α-半乳糖苷酶A（α-galactosidase A,α-Gal A）基因（GLA）突變引起[33]。α-Gal A 能夠催化球形三酰神經酰胺（globotriaosylceramide,Gb3）部分水解，因此，α-Gal A的不足會導致血漿中Gb3和其他鞘糖脂水平升高，并在各種器官組織的細胞內積累，引起一系列臟器病變[34]。2016年Pereira等[35]將CRISPR/Cas系統應用于人永生化足細胞，GLA敲除細胞如預期表現出法布里病生化表型，α-Gal A活性降低，Gb3水平升高，成功構建了靶向GLA的人永生化足細胞法布里病模型。該模型為檢驗法布里病發(fā)病機制假說提供了有力的工具。

2.3 CRISPR/Cas系統在異種腎移植中的應用 腎移植是目前治療終末期腎臟病最有效的方法。與維持性血液透析相比，腎移植可顯著提高患者的生活質量，降低死亡率[36]。盡管醫(yī)學取得了較大的進步，人們對器官捐獻和移植的認識也有所提高，但供求之間的差距仍在繼續(xù)擴大。據估計，在美國有超過10萬名患者在等待腎移植[37]。異種移植為緩解人體器官捐贈長期短缺的問題提供了可能性。豬腎目前被認為是臨床移植理想的供體器官來源。這在很大程度上是因為豬腎在大小、結構、腎小球濾過率、內源性肌酐清除率等主要生理指標上與人腎相似[38-39]。然而異種腎移植仍然面臨著一些難題，由于豬的體內存在內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retroviruses,PERVs），移植動物的器官后可能引發(fā)人類出現新的疾病。2015年Yang等[40]利用CRISPR/Cas系統將豬的PERV基因徹底破壞，證明了豬腎用于腎臟異種移植的可能。此外，與人體器官相比，異種器官的移植后免疫排斥反應更嚴重。為了解決這個難題，2018年Adams等[41]利用CRISPR/Cas技術敲除豬細胞分別負責α-半乳糖殘基（α-galactosyl residues,α-Gal）和Sda這兩種異種抗原生成酶相關的基因GGTA1和B4GALNT2，從而克服了超急性排斥反應。研究者通過以野生型豬外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）為對照，對GGTA1/B4GALNT2基因敲除的PBMCs進行表型分析，發(fā)現GGTA1/B4GALNT2基因敲除的PBMCs完全不含α-Gal和Sda兩種抗原，而對照組的兩種抗原均呈強陽性，說明不存在脫靶效應。不久前，美國紐約大學成功實施了全球首例轉基因豬腎移植人體手術，且未立即出現排斥反應，為解決移植器官短缺問題帶來曙光[42]。

3 展望

本文介紹了CRISPR/Cas系統的發(fā)現、基本原理、分類及其在腎臟疾病研究中的應用。最近開發(fā)的CRISPR/Cas系統能夠有效地在各種生物體和細胞類型中精確修改基因組，現已成為研究包括腎臟在內許多系統疾病的有力工具。雖然CRISPR/Cas系統具有操作簡單、效率高、特異性強、應用多樣等諸多優(yōu)點，但仍存在一些缺陷，如遞送效率低、脫靶效應等。如何恰當地將CRISPR傳遞到特定器官以糾正突變，以及如何從基因上設計包含適合移植的人體器官的嵌合體需要進一步探討。未來的腎臟疾病研究應基于強有力的臨床前數據，將這種強大的技術安全有效地應用于確定補充或改進現有療法的有效策略。筆者相信技術進步和新應用的快速發(fā)展無疑會使CRIPSR/Cas系統成為未來腎臟疾病研究的重要組成部分。