銅綠假單胞菌感染性肺炎患者的病原菌特征和肺表面活性蛋白B基因多態性和疾病進展與抗菌療效的關系

沈林華

紹興第二醫院呼吸內科，浙江紹興 312000

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）感染是醫院感染的常見類型之一，其檢出率高、耐藥性強及致死率高等特點導致PA感染性肺炎治療難度大，患者預后差，病死率高。目前PA感染性肺炎已成為臨床醫學抗感染領域亟待解決的棘手問題[1,2]。隨著抗菌藥物的問世，臨床上有效解決了感染問題，但其不合理應用也導致細菌耐藥性問題日益嚴重，近年來耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（carbapenem–resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）的檢出率呈增高趨勢，甚至出現多重耐藥銅綠假單胞菌（multi–drug resistancePseudomonas aeruginosa，MDRPA）和泛耐藥銅綠假單胞菌（pan–drug resistancePseudomonas aeruginosa，PDRPA），大大增加了臨床對感染患者的治療難度。因此，對醫院PA感染發生率和耐藥菌進行統計，有利于臨床合理選擇治療方案[3,4]。PA感染性肺炎患者常伴有不同程度的肺損傷，常出現咯血、胸痛、低熱和呼吸困難等癥狀，肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭，損傷到一定程度會出現急性呼吸窘迫綜合征[5-7]。嚴重的肺損傷不僅加重PA感染性肺炎患者的感染概率，還嚴重影響患者康復，因此對感染患者發生肺損傷進行早期預測并及時干預具有重要的臨床意義。研究表明，肺表面活性物質能夠降低肺泡表面張力，肺表面活性物質蛋白B（surfactant protein B，SP–B）是肺表面活性物質發揮功能的重要載體，其基因多態性是引起新生兒急性呼吸窘迫綜合征的重要因素，同時與肺部疾病易感性有關[8,9]。因此本研究通過分析SP–B基因多態性與PA感染性肺炎患者肺損害間的關系，擬通過SP–B基因多態性對患者是否發生肺損傷進行預判。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年8月至2021年8月紹興第二醫院收治的102例肺炎患者的臨床資料，根據是否感染PA分成PA組（n=36）和非PA組（n=66）。兩組患者年齡、性別和病程等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。納入標準：①參照《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷與治療指南（2006）》[10]中肺損傷的診斷標準，確診為肺損傷；②經病原菌檢測確診為PA感染，痰培養至少連續2次為PA，且半定量均為（+++）以上；③無抗生素過敏史。排除標準：①合并肺水腫、肺栓塞等其他肺部疾病；②嚴重肝、腎等重要器官功能不足；③合并其他感染性疾病；④惡性腫瘤患者；⑤臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗 依據《全國臨床檢驗操作規程（第2版）》[11]，按要求分離致病菌菌株，觀察菌落生長狀況。采用法國生物梅里埃有限公司的VITEK32 全自動微生物分析儀鑒定菌株，質控菌株金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、大腸埃希菌（ATCC 25922）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）均購自國家衛生健康委臨床檢驗中心。采用K–B紙片擴散法檢測菌株對常用抗菌藥的敏感性，按照2019年版臨床實驗室標準化協會的標準進行藥敏結果判讀。

1.2.2 DNA提取 采集所有研究對象外周靜脈血標樣3ml，加入乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA））抗凝，離心分離血漿，常規酚–氯仿法從外周血白細胞中提取基因組DNA，嚴格按照外周血DNA提取試劑盒（北京百奧森泰生物技術有限公司）說明書操作，將提取出的DNA樣本放置于–20℃低溫箱備用。

1.2.3 合酶鏈式反應–限制性片段長度多態性分析 根據GeneBank數據庫提供的基因序列設計聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物[12]（上海碧云天生物技術有限公司），反應總體積10μl。

SP–B基因1580 C/T位點PCR反應條件：95℃預變性5min、95℃變性45s、65.5℃退火45s、72℃延伸1min，重復變性、退火和延伸3個步驟5個循環，每個循環退火溫度降低0.5℃，95℃變性45s，59.5℃退火45s、72℃延伸1min，再重復變性、退火和延伸3個步驟30個循環，72℃延伸10min。

引物序列：F：5’–CTCGAATTCCGTGAACTCC AGCACCACCC–3’，R：5’–GTGAGCTTGCAGCCCTC TCA–3’，270bp，內切酶為DdeⅠ。SP–B基因8714 G/C位點PCR反應條件：95℃預變性5min、95℃變性45s、63.5℃退火45s、72℃延伸1min，重復變性、退火和延伸3個步驟5個循環，每個循環退火溫度降低0.5℃，95℃變性45s，57.5℃退火45s、72℃延伸1min，再重復變性、退火和延伸3個步驟30個循環，72℃延伸10min。引物序列：F：5’–CTCGAATTCAGGACA TACACACAGTCCT–3’。R：5’–CCAGCTGAGCTTTC AGCAGA–3’，784bp，內切酶為HinfⅠ。

產物用1.5%～3.0%瓊脂糖凝膠電泳1h，自動凝膠成像系統分析。

1.2.4 肺功能測定 采用日本MINATO AS507肺功能檢查儀測定肺功能，記錄記錄用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、一秒鐘用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）和FEV1/FVC；意大利科時邁PET型肺功能儀測定患者一氧化碳彌散值（diffusing capacity of the lung for carbon monoxide，DLCO），記錄DLCO占預計值的百分比[（DLCO（%）]；使用PERIFLUX經皮血氧分壓監測儀檢測患者血氧分壓（blood oxygen partial pressure，PaO2）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，Hardy–Weinberg平衡檢驗樣本的群體代表性，頻率比較采用χ2檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PA感染情況

102例肺炎患者共檢出PA36株，占肺炎患者35.29%；檢測結果為CRPA感染6例，占PA感染患者的16.67%；檢測結果為MDRPA感染12例，占PA感染患者的33.33%；檢測結果為PDRPA感染2例，占PA感染患者的5.56%。各年度PA感染率以及CRPA、MDRPA和PDRPA發生率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 36株PA抗菌療效分析

36例PA感染患者對氨芐西林全部耐藥，其次為阿莫西林和美羅培南；36例PA感染患者對環丙沙星和妥布霉素敏感，見表1。

表1 36株PA抗菌療效分析

2.3 肺炎患者SP–B基因1580位點基因多態性

樣本群體代表性符合Hardy–Weinberg平衡檢驗，PA組1580位點基因型TT、TC和CC的分布頻數與非PA組比較，差異有統計學意義（P<0.05），等位基因T的頻率明顯低于非PA組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 肺炎患者SP–B基因1580位點基因多態性

2.4 肺炎患者SP–B基因8714位點基因多態性

樣本群體代表性符合Hardy–Weinberg平衡檢驗，PA組8714位點基因型GG、GC和CC的分布頻數與非PA組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；等位基因G的頻率低于非PA組，但差異無統計學意義（χ2=1.445，P=0.486），見表3。

表3 肺炎患者SP–B基因8714位點基因多態性

2.5 SP–B基因1580位點不同基因型患者肺功能水平比較

根據位點多態性研究結果，選擇位點多態性具有顯著差異性的SP–B基因1580位點進行肺功能水平研究，研究對象為PA組患者。SP–B基因1580位點CC、CT和TT基因型患者肺功能水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05），TT基因型患者PaO2、DLCO和FEV1/FVC明顯高于CT和TT基因型患者，FVC、FEV1明顯低于CT和TT基因型患者，差異均有統計學意義（P<0.05），見表4。

表4 SP–B基因1580位點不同基因型患者肺功能水平比較（±s）

表4 SP–B基因1580位點不同基因型患者肺功能水平比較（±s）

注：△1mmHg=0.133kPa

3 討論

我國醫院感染病原菌仍以PA、克雷伯菌和腸桿菌屬等革蘭陰性菌為主，因此對感染病原菌特征和耐藥性進行研究對指導臨床合理用藥、規避耐藥風險具有重要意義[13]。PA感染性肺炎患者和普通肺炎患者的SP–B基因多態性與ARDS等肺損傷疾病被認為與基因突變有關，主要由于缺乏肺表面活性物質。SP–B是構成肺表面活性物質的重要蛋白，其含量和活性的改變會對肺功能產生影響進而引起肺部相關疾病，影響疾病進展[14-16]。

本研究結果顯示，PA感染性肺炎患者占肺炎患者的35.29%，其中CRPA感染占總感染人數的16.67%，MDRPA感染占總感染人數的33.33%，PDRPA感染占總感染人數的5.56%，說明PA是醫院獲得性感染病原菌中的重要組成部分。此外，PA感染患者往往存在多重耐藥的特征，是臨床治療困難的重要因素。通過對PA感染患者進行耐藥性分析，36例PA感染患者對氨芐西林全部耐藥，其次為阿莫西林和美羅培南，說明PA感染患者對β–內酰胺類抗生素和碳青霉烯類抗生素耐藥性較高。郭咸希等[17]對133例痰培養PA陽性患者抗菌藥物應用分析的研究顯示，PA對氨芐西林、阿莫西林和復方磺胺甲唑等抗菌藥物完全耐藥，亞胺培南和美羅培南的耐藥性也超過50%，與本研究基本一致。此外，本研究中36例PA感染患者對環丙沙星和妥布霉素敏感率超過60%，說明PA感染患者對氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素較敏感，提示臨床可以使用這類抗生素予以治療，但其用法用量仍需結合實際情況。既往研究顯示，PA對慶大霉素、頭孢吡肟、環丙沙星和左氧氟沙星等抗生素的耐藥性低于20%[18]，與本研究部分一致。

SP–B基因具有高度多態性，其各區段包含多個單核苷酸多態性位點，既往研究已證實SP–B基因多態性能夠引起急性呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺疾病和先天性肺泡沉積癥等多種疾病[19-21]。本研究結果顯示，PA組SP–B基因1580位點基因型TT、TC和CC的分布頻數與非PA組具有顯著差異，PA組患者等位基因T的頻率明顯低于非PA組；SP–B基因8714位點基因型GG、GC和CC的分布頻數與非PA組無顯著差異，等位基因G的頻率低于非PA組，但差異無統計學意義，說明SP–B基因1580位點和8714位點多態性與患者是否對PA易感有關。根據位點多態性研究結果，選擇位點多態性具有顯著差異性的SP–B基因1580位點進行肺功能水平的研究，結果顯示SP–B基因1580位點CC、CT和TT基因型肺功能水平有顯著差異，TT基因型患者PaO2、DLCO和FEV1/FVC明顯高于CT和TT基因型患者，FVC、FEV1明顯低于CT和TT基因型患者。研究顯示，在肺功能不全人群中SP–B前蛋白表達水平較高，說明其水平與肺功能具有一定關聯[22-24]。SP–B基因1580位點C/T等位基因變化可以改變蛋白氨基末端糖基化位點，進而影響SP–B蛋白分泌、加工和折疊，導致蛋白質功能上的改變。有研究顯示，SP–B基因1580位點C等位基因是急性呼吸窘迫綜合征易感因素[25]。本研究結果顯示，肺功能水平越差的患者T等位基因頻率明顯降低，意味著C等位基因頻率明顯升高，C等位基因的明顯升高使患者對肺損傷疾病易感，與既往研究結果一致。SP–B基因8714位點位于編碼區外，其基因多態性對肺損傷易感性可能不具有顯著影響，但該位點等位基因變化仍舊能夠引起SP–B mRNA穩定性下降。從既往研究結果看，GG基因型在巴西白種人急性呼吸窘迫綜合征患者中分布頻率明顯升高[26]，因此認為G等位基因是急性呼吸窘迫綜合征易感基因，本研究結果也顯示肺功能水平較差的患者G等位基因增高，但可能受樣本量因素影響，致使PA組與非PA組差異不顯著。綜合SP–B基因1580位點和8714位點結果來看，這種基因多態性可能導致患者肺組織中SP–B蛋白水平和功能上的變化，可能與ARDS等肺損傷疾病的發生、發展有關，而SP–B基因1580位點和8714位點多態性與患者對PA易感有關和肺損傷程度有關，肺功能越差的患者和PA感染患者SP–B基因1580位點C等位基因頻率均明顯升高（T等位基因頻率明顯降低），SP–B 8714位點G等位基因均降低，因此可以初步推測PA感染性肺炎患者其肺損傷可能性越高。

綜上所述，PA感染性肺炎患者SP–B基因多態性與其肺部疾病進展具有一定關聯，臨床可以通過聯合檢測患者SP–B基因多態性對PA感染性肺炎患者是否發生ARDS等進行預測以指導臨床治療，通過合理規避肺部感染和肺部進一步損傷的危險因素以阻止肺損傷發生發展。本研究不足之處在于樣本數量有限，無法涵蓋所有可能性。同時，本研究僅初步建立SP–B基因的幾個代表性位點與PA感染性肺炎患者肺損傷進展之間的聯系，更多相關的基因多態性研究還需其他更深入的研究，不同地區、不同科室的病原菌分布和耐藥性可能會出現較大差異，臨床仍應以實際情況為主要原則指導用藥。